针对SARS冠状病毒重要蛋白的siRNA设计(英)

RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种特异性地导致转录后基因沉默的现象,在哺乳动物细胞中小分子干扰RNA双链体(small interfering RNA duplexes, siRNA duplexes)可以有效地诱导RNAi现象,为一些疾病的治疗开辟了新的途径.针对SARS冠状病毒(SARS coronavirus, SARS-CoV)中编码5个主要蛋白质的基因,用生物信息学的方法设计了348条候选siRNA靶标.在理论上,相应的siRNA双链体能特异地抑制SARS-CoV靶基因的表达,同时不会影响人体细胞基因的正常表达,这为进一步siRNA类药物的实验研究提供了理论基础.     

针对SARS冠状病毒S蛋白的RNAi设计

为研究SARS冠状病毒的RNA干涉,以S蛋白为目标选取16个RNA干涉的靶序列,并设计用于体内转录形成以U6为启动子的siRNA发夹结构的DNA,拟将设计的DNA瞬时转染靶细胞,用定量RT-PCR法确定目标RNA被干涉的程度,用Western blot在蛋白质水平上进行监测。针对SARS冠状病毒的RNAi设计为进一步研究奠定了理论基础,其工作的开展将在RNAi治疗、SARS冠状病毒基因功能研究、新药开发等方面发挥重要作用。     

siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用

为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对SARS冠状病毒复制的抑制作用,针对BJ0 1株SARS冠状病毒复制酶基因(Pol)和刺突蛋白基因(S) ,设计4个siRNA ,并构建相应的siRNA表达载体及克隆细胞系.利用间接免疫荧光法及实时定量反转录PCR法,检测所设计的siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用.结果表明,针对Pol基因的siRNA(psOe)在Vero细胞中可阻断BJ0 1株SARS病毒RNA的复制及其蛋白的表达.该结果为深入阐明SARS冠状病毒的致病机理及探讨SARS病毒防治新途径奠定了基础.     

针对leader序列的siRNA能够有效抑制SARS冠状病毒多个mRNA的表达

小干扰RNAs(siRNAs)能够有效降解具有互补序列的RNA.在SARS-CoV的基因组RNA和所有亚基因组RNA的5′端均有一段共同的leader序列,而且该leader序列在不同的病毒分离物中高度保守,因此leader序列可作为一个用于抑制SARS-CoV复制的有效靶点.研究表明,针对leader序列化学合成的siRNA和DNA载体表达的shRNA都可以有效抑制SARS-CoV mRNA的表达.Leader序列特异的siRNA或shRNA不仅可以有效抑制leader与报告基因EGFP融合基因的表达,而且还可以有效抑制leader与刺突蛋白(spikeprotein)、膜蛋白(membrane protein)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)基因的融合转录产物的表达.结果表明,针对leader序列的RNA干扰可以发展成为一种抗SARS-CoV治疗的有效策略.     

SARS冠状病毒M蛋白的生物信息学研究

针对GenBank上发布的来自不同国家地区的39条SARSCoV推测M蛋白,采用生物信息学软件分析其核酸和氨基酸序列,获得其分子生物学特征,确定突变位点,预测功能结构区、Motif及抗原决定簇,比较基因突变对这些功能结构的影响.结果表明:在39个病毒株M蛋白的666 bp中,共有18个病毒株在7个位点上发生了25次变异.在M蛋白序列上预测获得3个跨膜螺旋序列和一个可能的信号肽序列.氨基酸序列的变异主要发生在其跨膜和胞外区域,胞内区域相对较少.预测发现12个Motif和7个抗原决定簇.提示突变对M蛋白的结构功能区的影响不大,也未造成M蛋白的Motif的数量和构成发生改变.对抗原决定簇的影响也主要体现在序列成分构成的改变上,在设计疫苗时,应考虑由其导致的抗原特性改变.     

SARS冠状病毒的变异特性分析

通过对目前所发表或公布的CARS相关资料进行分析,结合所做的一些工作,对SARS-CoV的变异特性、影响变异的可能因素以及变异与Ⅰ临床病程发展的联系进行了探讨。结果显示,SARS．CoV在变异发生频率和动态变化上具有RNA病毒的普遍特性,但由于其在人类的传播时间较短,相对于常见的引起慢性感染的RNA病毒,如丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等,得到鉴定的变异序列数量相对较少。SARS-CoV5基因尤其是S1区变异程度较高,Ⅳ基因较为保守。就目前有限的研究结果分析,没有发现病毒变异与Ⅰ临床病程发展之间有明确的联系。     

SARS冠状病毒全基因组序列初步分析

对已经完成全序列测定的12个SARS病毒基因组进行了多序列比对,发现序列主体部分29708 b具有99．82％的相同碱基,除2个序列各有5个和6个碱基的缺失外,其余部分共有42个位点核苷酸碱基的差异,其中28个位点的碱基差异可引起氨基酸残基改变。利用蛋白质二级结构和跨膜螺旋预测以及蛋白质定位等生物信息学工具,分析了这些产生氨基酸改变部位的蛋白质构像,推测了可能产生的结构和功能改变,为进一步生物学实验提供参考。所有分析结果同时在北京大学生物信息中心抗SARS网站(antisars.cbi.pku．edu．cn)上发布。     

SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达

利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或／和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15％～30％之间。分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性最好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同—：活性水平。由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的。     

SARS冠状病毒NS融合蛋白的重组表达纯化与免疫学性质分析(英文)

刺突蛋白(S)和核心蛋白(N)是SARS冠状病毒的主要结构蛋白.在病毒细胞受体结合和病毒包装过程起重要作用.重组融合表达这2种蛋白具有较高的诊断学价值.对SARS病毒N蛋白和S蛋白氨基酸序列进行计算机分析,选择含有优势抗原表位的N蛋白1～227位氨基酸片段和S蛋白450～650位氨基酸片段,采用序列重叠延伸策略(sequenceoverlappingextension,SOE)构建编码N1227LinkerS450650新型融合蛋白的基因片段,导入原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌的高效表达.利用组氨酸标签亲和层析的方法纯化,获得高纯度的融合蛋白.对该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其免疫化学性质均无显著改变.采用ELISA和Western印迹方法对其识别SARS冠状病毒特异性抗体的能力进行初步鉴定,显示该融合蛋白具有较好的抗原性和特异性,可有效特异性地检测恢复期SARS病人血清中抗SARS冠状病毒结构蛋白的抗体,可以作为SARS冠状病毒感染的辅助诊断手段.     

SARS冠状病毒的起源研究进展

SARS冠状病毒（SARS-CoV）是一种新现病毒,可感染多种动物,果子狸是人类sARs-CoV重要的动物宿主之一,是已知较理想的实验动物模型。遗传因素在SARS-CoV的出现过程中起重要作用,它很可能是哺乳动物和鸟类冠状病毒之间重组产生的新物种,但发生基因重组不是SARS在人群中暴发的原因。     

SARS 冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性

SARS冠状病毒(SARS-CoV) 非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl) 具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少. 本研究构建包含Nsp3基因 N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性. 实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15 (DeISGylation) 活性. 研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro. 但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO (DeSUMOylation) 活性. SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

广东地区SARS-COV细胞培养模型的建立和初步应用

目的：建立中国广东地区SARS—CoV细胞培养模型。方法：通过将SARS—CoV广东地区分离株GD322在Vero E6细胞中连续传代,检测TCID50,获得稳定的细胞模型。利用此细胞培养模型,对不同温度、紫外线等条件下SARS-CoV的存活时间进行了比较。对重组人复合干扰素α抗病毒效果进行了筛查。结果与结论：SARS—CoV对外界环境抵抗力比普通冠状病毒强,对重组人复合干扰素α有较高的敏感性,抑制指数达4．9。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RTPCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB,电穿孔法将重组体整合人酵母菌P．pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut^-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut^-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。     

Immune Responses and Histopathological Changes in Rabbits Immunized with Inactivated SARS Coronavirus

To evaluate the immunogenicity of inactivated SARS coronavirus（SARS-CoV）,three groups of rabbits were immunized three times at 2-week intervals with inactivated vaccine ＋ adjuvant,adjuvant,and normal saline respectively.Eight batchs of serum were sampled from the auricular vein at day 7 to day 51,and specific IgG antibody titers and neutralizing antibody titers were detected by indirect ELISA and micro-cytopathic effect neutralizing test.Antibody specificity was identified by proteinchip assay.Histopathological changes were detected by H＆E staining.The results showed that,rabbits in the experimental group immunized with inactivated SARS-CoV all generated specific IgG antibodies with neutralizing activity,which suggested the inactivated SARS-CoV could preserve its antigenicity well and elicit an effective humoral immune responses.The peak titer value of specific IgG antibody and neutralizing antibody reached 1：40960 and 1：2560 respectively.In the experimental group,no obvious histopathological changes was detected in the H＆E stained slides of heart,spleen,kidney and testis samples,but the livers had slight histopathological changes,and the lungs presented remarkable histopathological changes.These findings are of importance for SARS-CoV inactivated vaccine development.     

Milligram scale production of potent recombinant small interfering RNAs in Escherichia coli

Small interfering RNAs (siRNAs) are invaluable research tools for studying gene functions in mammalian cells. siRNAs are mainly produced by chemical synthesis or by enzymatic digestion of double‐stranded RNA (dsRNA) produced in vitro. Recently, bacterial cells, engineered with ectopic plant viral siRNA binding protein p19, have enabled the production of “recombinant” siRNAs (pro‐siRNAs). Here, we describe an optimized methodology for the production of milligram amount of highly potent recombinant pro‐siRNAs from Escherichia coli cells. We first optimized bacterial culture medium and tested new designs of pro‐siRNA production plasmid. Through the exploration of multiple pro‐siRNA related factors, including the expression of p19 protein, (dsRNA) generation method, and the level of RNase III, we developed an optimal pro‐siRNA production plasmid. Together with a high–cell density fed‐batch fermentation method in a bioreactor, we have achieved a yield of ~10 mg purified pro‐siRNA per liter of bacterial culture. The pro‐siRNAs produced by the optimized method can achieve high efficiency of gene silencing when used at low nanomolar concentrations. This new method enables fast, economical, and renewable production of pure and highly potent bioengineered pro‐siRNAs at the milligram level. Our study also provides important insights into the strategies for optimizing the production of RNA products in bacteria, which is an under‐explored field.