马传染性贫血病毒强、弱毒株dUTPase结构与酶活性比较

为研究尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)在马传染性贫血病毒(equine infectous anemia virus,EIAV)致弱过程中的作用,探索dUTPase结构与功能的关系,分别对EIAV强、弱毒株dUTPase的编码基因进行了结构分析,并在大肠杆菌中进行了表达.经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金属亲合层析方法对表达产物纯化后,用3H标记底物的方法测定了重组强、弱毒株dUTPase的活性.证明所表达的两种重组dUTPase均具有水解dUTP的功能,但重组弱毒株dUTPase的活性显著高于重组强毒株dUTPase的活性.结果提示,由于EIAV疫苗株在驴白细胞上连续传代培养,使病毒dUTPase的活性增强和复制能力提高,而决定酶活性改变的分子基础是dUTPase编码基因中的两个氨基酸发生了突变.此结果对其它慢病毒病的免疫预防具有重要参考价值.     

泡沫病毒Gag蛋白的研究进展

Gag蛋白在逆转录病毒复制周期的许多阶段中发挥重要作用。泡沫病毒基因组结构与其它逆转录病毒类似,但它们的基因组成分和生活周期存在明显差异,这在一定程度上是由其Gag蛋白的结构和功能所决定的。本文对18种不同株型的泡沫病毒gag基因序列进行进化树分析,探究不同来源的泡沫病毒的亲缘关系;并以典型的原型泡沫病毒为代表,阐述泡沫病毒Gag蛋白的结构和功能以及对病毒复制不同阶段的影响。     

马传染性贫血病毒囊膜基因的研究进展

马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一 ,不仅与人免疫缺陷病毒具有序列同源性 ,而且与其血清具有交叉反应。马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗是迄今为止唯一研究成功的慢病毒疫苗。在马传贫病毒囊膜基因的研究中有助于弄清其抗原变异、持续感染和疫苗免疫机理 ,为艾滋病疫苗的研究提供借鉴。对囊膜基因的结构、变异及其在机体免疫应答中的作用进行了讨论。     

马传染性贫血发病过程中细胞毒性T细胞的作用及其表位研究进展

马传染性贫血(Equine infectious anemia,EIA)是马属动物感染的一种主要经由虫媒传播的传染性疾病。该病的临床表征为反复发热、贫血、出血、水肿以及消瘦等,病理生理变化以血小板减少为主[1]。EIA的致病原为马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV),该病毒与人     

鸡传染性贫血病毒研究进展

鸡传染性贫血病毒研究进展卢春，陈溥言，蔡宝祥（南京农业大学动物医学院，南京２１００９５）ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＣｈｉｃｋｅｎＡｎａｅｍｉａＶｉｒｕｓ￥ＬｕＣｈｕｎ；ＣｈｅｎＰｕｙａｎ；Ｂａｏｘｉａｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉ...     

鸡马立克病病毒Meq蛋白抑制p53的转录激活作用

目的　构建马立克病病毒野生型Meq基因（Meq-wt）和p53结合区域缺失的突变型Meq基因（Meq-mut）表达质粒,研究Meq蛋白对p53的转录激活功能的影响,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法 采用PCR方法克隆马立克氏病毒Meq-wt基因,并采用突变PCR方法缺失Meq与p53结合区域,分别构建了Meq-wt和Meq-mut基因表达质粒。转染鸡胚成纤维细胞（CEF）后,用western印迹法检测Meq蛋白的表达,利用荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活的抑制作用。同时借助免疫荧光技术,采用荧光显微镜观察Meq蛋白与p53蛋白在细胞中的定位。结果 DNA序列测序表明克隆的Meq-wt、Meq-mut基因插入位点和核苷酸序列完全正确。荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活的具有明显的抑制作用。间接免疫荧光试验证实野生型Meq蛋白主要在胞浆中表达,而缺失与p53结合区域的突变型Meq在胞浆/胞核中均有表达。野生型Meq蛋白与内源性p53蛋白在胞核内能够很好地重合。 结论 Meq蛋白对p53的转录激活具有抑制作用,可能是通过直接与p53相互结合,来抑制对p53转录活性功能。     

马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGNl91N236N246.将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性.结果表明,在FDD细胞中盲传三代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒.这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础.     

马传染性贫血病毒基因组部分转录图谱

以马传贫驴白细胞弱毒和驴强毒分别接种培养细胞和试验动物,分别在体外和体内条件,对病毒的各种转录产物进行克隆和序列分析。通过与病毒基因组的序列进行比较,用实验的方法绘制出了两株病毒在相应试验条件件下的转录图谱,确定了各拼接产物的外显子构成以及拼接供体和拼接受体位点的具体位置。发现两种病毒在外显子－3的上游拼接受体位点（SA2）的位置与已报道的EIAV毒株均不相同,且二者的拼接信号不一致。     

感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建

在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8。按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆。利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒。这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础。     

免疫抑制对EIAV弱毒疫苗免疫马体内疫苗弱毒株载量的影响

为了研究马传染性贫血弱毒疫苗EIAVFDDV在体内的生物学特性,特别是在免疫马血浆中低拷贝存在状态的形成原因,使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫马匹进行了免疫功能抑制．连续给药10天后,以植物血凝素（PHA）作为刺激原的淋巴细胞非特异性增殖实验表明,实验马匹的免疫系统功能受到了明显抑制．使用实时RT-PCR对免疫抑制前后实验马匹体内EIAVFDDV的载量进行了定量检测．结果显示,EIAVFDDV免疫马匹体内的病毒载量在2匹马中未见升高,1匹马体内略有增高,但仍处于EIAVFDDV在免疫马匹体内载量的正常范围．作为对照,强毒株隐性携带马的病毒载量提高了约25000倍,并出现了典型的临床症状．实验结果提示,致弱后病毒特有的生物学特性,而非免疫压力,是EIAV疫苗株在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因．同时,在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在免疫马体内仍然表现出了相对稳定的低拷贝复制状态,进一步显示了EIAVFDDV在应用中的安全性．     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株酸性蛋白p9基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码p9蛋白的基因,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白,其氨基端带有6个组氨酸的标签,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中,重组的酸性蛋白p9可与马传贫阳性血清样品发生反应,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究 。     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE/L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVenv和rvv-LNenv,Western blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28%.本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础.     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE／L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv—DINenv和rvv—LNenv,Westem blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。     

Systematic epitope analysis of the p26 EIAV core protein

The major core protein of equine infectious anemia virus (EIAV), p26, is one of the primary immunogenic structural proteins during a persistent infection of horses and is highly conserved among antigenically variants of viral isolates. In order to investigate its immune profile in more detail for a better diagnostic, an epitope mapping was carried out by means of two libraries of overlapping peptide fragments prepared by simultaneous and parallel SPPS on derivatized cellulose membranes (SPOT synthesis). Polyclonal equine sera from infected horses were used for the biological assay. Particularly two promising continuous epitopes (NAMRHL and MYACRD) were localized on the C-terminal extreme of p26, region 194-222. A cyclic synthetic fragment of 29 amino acid residues containing the identified epitopes was designed and studied. A significant conformational change towards a helical structure was observed when the peptide was cyclized by a bridge between Cys198 and Cys218. This observation correlated with an improvement of its ability to be recognized by specific antibodies in an EIA (Enzyme-linked Immunosorbent assay). These results suggest that the conformationally restricted synthetic antigen adequately mimics the native structure of this region of p26 core protein.     

The EDEM and Yos9p families of lectin-like ERAD factors

Protein quality control pathways monitor the folding of newly synthesized proteins throughout the cell. Irreversibly misfolded proteins are sorted and degraded to neutralize their potential toxicity. In the secretory pathway, multiple strategies have evolved to test the wide diversity of molecules that traffic through the endoplasmic reticulum. The organelle has adapted the use of N-linked glycans to signal protein folding states. The signals are read by the EDEM and Yos9 protein families that take substrates out of folding cycles for degradation.     

马传染性贫血病毒白细胞弱毒疫苗株及其亲本毒驴强毒株前病毒基因组比较分析

为阐明马传染性贫血白细胞弱毒疫苗株(EIAVDLV)的致弱和免疫保护机理,对EIAVDLV121及其亲本驴强毒株(EIAVDV117)前病毒全基因组序列进行了测定,并结合准种理论,分析了EIAV疫苗致弱过程中基因组进化特点。利用LA-PCR技术对EIAVDV117和EIAVDLV121的前病毒基因组分两段进行扩增,分别获得4个和10个前病毒全基因组序列。EIAVDV117前病毒基因组平均为8236bp,G C含量38.0。EIAVDLV121前病毒基因组平均8249bp,G C含量37.3。两者的前病毒基因组平均差异率为2.8。其中S2、LTR和env基因差异较大,分别为4.1、3.9和3.1。此外,S2、S3和env推导的氨基酸的差异明显,分别为10.4、5.6和4.8(gp90为6.8)。EIAVDLV121各基因的异质性均显著高于EIAVDV117。研究发现体外培养的EIAVDLV121至少有5种类型的LTR混合存在。在gp90推导的氨基酸序列上,EIAVDV117比EIAVDLV121平均多2个N-糖基化位点,总数为19,其中3个为EIAVDV117特有。EIAVDLV121有1个疫苗株特有N-糖基化位点。研究结果为进一步探讨马传染性贫血弱毒疫苗生物学特性提供信息。