蛋白激酶C 在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞收缩中的作用

目的:研究蛋白激酶C(pkc)在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞(GMC)收缩中的作用。方法:人肾小球系膜细胞系用于全部实验。应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激蛋白激酶C抑制剂白屈菜红碱(CHE)处理或未处理的系膜细胞。利用激光扫描共聚焦显微镜测细胞内钙离子浓度。结果:①膜细胞经AngⅡ诱导后,细胞出现明显的大幅度起始钙离子浓度升高(vs.control,p<0.05,n=16)②膜细胞经CHE预处理后减少AngⅡ诱导的GMC钙离子浓度(vs AngⅡ,p<0.05,n=16)。结论:①血管紧张素Ⅱ诱导系膜细胞收缩。②蛋白激酶C参与血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞的收缩过程。     

氧化低密度脂蛋白促进培养的人肾小球系膜细胞LOX-1表达

目的:研究氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)对人肾小球系膜细胞植物血凝素样受体(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor,LOX-1)表达。方法:不同浓度的Ox-LDL和培养的人肾小球系膜细胞共孵育,应用Real-time PCR和Western Blot方法检测Ox-LDL对人肾小球系膜细胞LOX-1表达的影响。结果:Ox-LDL剂量和时间依赖性促进人肾小球系膜细胞LOX-1mRNA和蛋白表达。Ox-LDL 40μg/mL刺激细胞0-24小时,于12小时达峰值。Ox-LDL 10、20、40、60μg/mL分别作用于细胞12小时,40μg/mL组达到峰值,为基础值的3.73倍。Ox-LDL 40μg/mL刺激细胞0-24小时,LOX-1蛋白24小时达高峰,Ox-LDL 10、20、40、60μg/mL分别作用细胞24小时,40μg/mL组细胞LOX-1蛋白达到峰值,为基础值的1.81倍。结论:Ox-LDL在一定浓度范围内剂量和时间依赖性促进人肾小球系膜细胞LOX-1表达。     

蛋白激酶C在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞收缩中的作用

目的：研究蛋白激酶C（pkc）在血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞（GMC）收缩中的作用。方法：人肾小球系膜细胞系用于全部实验。应用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激蛋白激酶C抑制剂白屈菜红碱（CHE）处理或来处理的系膜细胞。利用激光扫描共聚焦显微镜测细胞内钙离子浓度。结果：①膜细胞经AngⅡ诱导后,细胞出现明显的大幅度起始钙离子浓度升高（vs．control,p〈0．05,n=16）⑦膜细胞经CHE预处理后减少AngⅡ诱导的GMC钙离子浓度（vsAngⅡ,p〈O．05,n=16）。结论：①血管紧张素Ⅱ诱导系膜细胞收缩。②蛋白激酶C参与血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞的收缩过程。     

Ⅰ型胶原,内皮素对肾小球内皮细胞及系膜细胞产生细胞外基…

本文观察了Ⅰ型胶原，内波素对肾小球内皮细胞、系膜细胞增殖的影响，同时探讨了Ⅰ型胶原和内皮素对培养的内皮细胞及系膜细胞产生层粘连蛋白、纤连蛋白和Ⅳ型胶原的影响。结果提示：Ⅰ型胶原可以明显促进内皮细胞的增殖，内皮素对系膜细胞的增殖有一定作用；Ⅰ型胶原可以促进内皮细胞产生层粘连蛋白和纤连蛋白，并可以促进系膜细胞产生Ⅳ型胶原；内皮素可以促进系膜细胞产生ＦＮ增多。     

Ⅰ型胶原、内皮素对肾小球内皮细胞及系膜细胞产生细胞外基质的影响

本文观察了Ⅰ型胶原、内皮素对肾小球内皮细胞、系膜细胞增殖的影响,同时探讨了Ⅰ型胶原和内皮素对培养的内皮细胞及系膜细胞产生层粘连蛋白、纤连蛋白和Ⅳ型胶原的影响。结果提示:Ⅰ型胶原可以明显促进内皮细胞的增殖(P<0.01),内皮素对系膜细胞的增殖有一定作用:Ⅰ型胶原可以促进内皮细胞产生层粘连蛋白和纤连蛋白,并可以促进系膜细胞产生Ⅳ型胶原;内皮素可以促进系膜细胞产生FN增多(P<0.05)。     

肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能及其影响因素

本文利用激光扫描共聚焦显微镜及荧光漂白后荧光回复技术对人肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能及其影响因素进行了观察。结果发现,体外培养的肾小球系膜细胞在融合生长状况下,相邻两细胞有间隙连接结构形成。不同浓度的血管紧张素Ⅱ对肾小球系膜细胞间隙连接的通讯功能具有促进作用,而甲基强的松龙则具有抑制作用。     

血管紧张素受体1在血管紧张素Ⅱ诱导人星形胶质细胞老化中的作用

目的通过体外细胞实验研究,探讨血管紧张素受体1在血管紧张素Ⅱ诱导人星形胶质细胞活性氧产生和细胞老化中的作用。方法人星形胶质细胞随机分为三组：血管紧张素Ⅱ＋Cand（坎地沙坦）组和血管紧张素Ⅱ＋tempol组。血管紧张素Ⅱ组是用100nM血管紧张素Ⅱ刺激人星形胶质细胞3天,血管紧张素Ⅱ＋Cand组和血管紧张素Ⅱ＋tempol组先用血管紧张素受体1阻滞剂坎地沙坦（100nM）和氧自由基清除剂tempol（3mM）预处理,再用100nM血管紧张素II刺激人星形胶质细胞3天,利用β半乳糖苷酶染色评估细胞老化。不同剂量（0、1nM、10nM、100nM、1000nM和1000nM＋坎地沙坦）的血管紧张素Ⅱ刺激人星形胶质细胞30min,DHE染色评估细胞内活性氧产生。结果血管紧张素Ⅱ引起人星形胶质细胞DHE染色表达增多和β半乳糖苷酶染色细胞增多。利用血管紧张素受体1阻滞剂坎地沙坦和氧自由基清除剂tempol预处理逆转了血管紧张素Ⅱ引起的星形胶质细胞老化。结论血紧张素Ⅱ是通过血管紧张素受体1和超氧阴离子产生引起星形胶质细胞的老化。     

AngⅡ对血管平滑肌细胞PDGF受体表达的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞血小板源生长因子(PDGF)受体表达的影响.方法:采用大鼠主动脉球囊内皮剥脱术制备主动脉再狭窄模型,观察形态学变化;放免法测定主动脉AngⅡ含量;免疫印迹法测定主动脉PDGF-β受体含量,并与假手术组相比较.培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),AngⅡ刺激正常培养的与洛沙坦预处理过的VSMC 6 h,测定PDGF-β受体含量.结果:球囊内皮剥脱术后14 d,主动脉中层VSMC大量增殖,内膜显著增厚,AngⅡ含量显著升高(P＜0.05),PDGF-β受体表达显著增强(P＜0.05).AngⅡ诱导VSMC PDGF-β受体表达显著增强(P＜0.01),AngⅡ受体拮抗剂洛沙坦完全抑制AngⅡ对PDGF-β受体上调的诱导作用.结论:AngⅡ可通过其Ⅰ型受体诱导血管平滑肌细胞PDGF受体上调,这可能是AngⅡ促VSMC发生增殖的一个重要机制.     

长链非编码RNA 1500026H17Rik对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的影响

为了探讨长链非编码RNA 1500026H17Rik对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响,采用qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)检测1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及在高糖和低糖条件下培养的肾小球系膜细胞中的表达水平;扩增小鼠1500026H17Rik的全长序列,将其克隆到pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒,并设计合成si RNA;将1500026H17Rik-si RNA和pcDNA(+)-1500026H17Rik过表达质粒分别转染至高糖或低糖培养的肾小球系膜细胞中,通过5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethyny1-2′-doexyuridine,Ed U)检测肾小球系膜细胞的增殖能力。结果表明,在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和高糖培养的系膜细胞中1500026H17Rik表达水平显著提高。在低糖培养的系膜细胞中转染pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒后与低糖培养的系膜细胞或空质粒转染对照组相比,低糖1500026H17Rik过表达的肾小球系膜细胞的增殖能力明显提高。同时,将通过qRT-PCR筛选出的一条敲低效率最佳的1500026H17Rik-si RNA转染至高糖培养的系膜细胞后,与高糖培养的系膜细胞或si RNA转染对照组相比,1500026H17Rik敲低的肾小球系膜细胞的增殖能力明显减弱。lnc RNA-1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中呈高表达,且影响高低糖培养的肾小球系膜增殖,提示1500026H17Rik可能参与了糖尿病肾病的发生。     

LncRNA H2k2促进高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的研究

该研究主要探讨lncRNA H2k2对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的影响,采用qRTPCR检测lncH2k2在正常及糖尿病肾病小鼠肾脏组织中的表达,以及高低糖培养的系膜细胞中的表达;FISH与qRT-PCR检测lncH2k2的亚细胞定位;qRT-PCR检测lncH2k2过表达质粒及siRNA的转染效率;EdU检测转染lncH2k2过表达质粒或siRNA后系膜细胞增殖的变化。结果表明,lncH2k2在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及高糖培养的系膜细胞中的表达升高,且lncH2k2主要分布于系膜细胞的细胞质中。在低糖培养的系膜细胞中转染lncH2k2过表达质粒后,与低糖培养的系膜细胞相比,过表达lncH2k2的低糖培养的系膜细胞增殖能力显著提高,并且将qRT-PCR检测筛选出的一条lncH2k2 siRNA转染到高糖培养的系膜细胞内,与高糖培养的系膜细胞相比,敲低lncH2k2后系膜细胞增殖能力显著降低。研究结果揭示,lncRNA H2k2在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及系膜细胞中表达显著,lncRNA H2k2促进了系膜细胞增殖,这些结果表明,lncRNA H2k2可能参与了糖尿病肾病的发生发展。     

缺血性肾损害时肾小球系膜细胞内皮素A受体mRNA表达的检测

目的　采用夹闭双肾动脉方法建立缺血性肾损害动物模型 ,探讨缺血性肾损害时肾小球系膜细胞内皮素A受体mRNA表达的情况。方法　应用地高辛标记的ETARcDNA探针进行的原位杂交检测肾脏系膜细胞的内皮素A受体mRNA的表达 ,结果　显示缺血性肾损害组动物的肾脏系膜细胞内此素A受体mRNA表达明显高于假手术对照组 ,P <0 0 5。提示 :内皮素可能参与了该疾病的发病过程     

血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对非酒精性脂肪性肝炎治疗作用的研究

目的 研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(洛沙坦)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗作用.方法 采用自身对照的方法,30例同时患有NASH与高血压的患者给予洛沙坦(50 mg/d)治疗,持续1年.结果 治疗后,患者血清TGF-β1、ALT及铁蛋白水平显著下降,同时病理学检查证实20例患者(67％)出现肝脏炎性坏死的减轻、15例患者(75％比例?)出现铁沉积的消失.此外,在治疗的过程中没有发现任何副作用.结论 本研究提示血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可能对NASH具有治疗作用.     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

全反式维甲酸对SD大鼠系膜细胞株增殖和Ⅳ型胶原的影响

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖及Ⅳ型胶原的影响.方法:以高糖(葡萄糖浓度为25mmol.1-1)刺激体外培养的大鼠MCs增殖,然后根据实验分组加入不同浓度的ATRA:对照组:5.6mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基;实验组:25 mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基+不同浓度的ATRA(分别为0 mol.1-1、10-8 mol.1-1、10-7mol.1-1、10-6mol.1-1,采用MTT比色法观察12、24、48h系膜细胞的增殖情况;Elisa法测定12、24、48h细胞上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果:ATRA有抑制高糖所致的MCs增殖、减少细胞外基质(ECM)的作用,并呈剂量时间依赖性.结论:ATRA对高糖所致MCs增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性.     

通络方剂对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞体外增殖作用和氧化应激的影响

采用体外培养大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs),MTT法检测RMCs增殖,DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)生成,RT-PCR和Western blot检测铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白表达,探讨不同浓度通络方剂对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞(RMCs)体外增殖作用和氧化应激的影响。结果提示高糖条件下,通络方剂可抑制RMCs增殖(P0.05),抑制活性氧生成(P0.05),该抑制作用呈浓度依赖模式;高糖作用于RMC后,MnSOD和FN mRNA和蛋白水平升高,通络方剂可抑制高糖条件下FN mRNA的升高和提高正常糖浓度条件下MnSOD蛋白水平,浓度依赖性地抑制高糖条件下FN蛋白的表达。因此,通络方剂可抑制高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞增殖,抑制氧自由基生成,提高抗氧化酶活性。     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

紫杉醇调节TIMP-1启动子活性及TIMP-1降低紫杉醇对乳腺癌细胞增殖抑制作用的研究

目的 探讨TIMP-1在降低MCF-7对紫杉醇敏感性中的作用。方法 采用DNA重组技术构建含timp-1基因启动子的荧光素酶报告质粒并瞬时转染MCF-7细胞,在撤血清条件下测定荧光素酶的相对活性,以验证重组质粒的有效性;重组质粒瞬时转染入MCF-7细胞中,经紫杉醇处理后,测定荧光素酶的相对表达活性;检测在紫杉醇作用下,TIMP-1过表达克隆与对照克隆细胞增殖的情况。结果 酶切、PCR及测序鉴定结果证实成功构建带有TIMP-1启动子的报告基因表达质粒;且撤血清条件下TIMP-1启动子转录活性显著增强,1000nmol／L紫杉醇处理的MCF-7细胞中TIMP-1启动子调控的荧光素酶活性显著降低;紫杉醇对TIMP-1过表达克隆的细胞增殖抑制作用显著低于对照克隆。结论 成功地构建了含timp-1基因启动子的荧光素酶报告质粒,准确地评价TIMP-1启动子在紫杉醇作用过程中的活性变化,并进一步阐明TIMP-1在降低乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性中的作用。     

miR-152靶向AT1R对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的:探讨微小RNA-152(mi R-152)靶向血管紧张素受体(AT1R)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。方法:采用1μmol/L AngⅡ刺激体外培养的大鼠心肌成纤维细胞,通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,蛋白免疫印迹(Western blot)检测成纤维细胞中胶原蛋白I(Collagen I)、胶原蛋白I(Collagen Ⅲ)以及AT1R蛋白表达的影响,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测成纤维细胞中mi R-152和AT1R m RNA的表达。在AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞中分别转染mi R-152 mimic和mimic control、AT1R si RNA和si RNA control以及共转染mi R-152 mimic和AT1R过表达载体,以同样的方法检测细胞增殖和胶原合成情况。双荧光素酶报告基因实验检测mi R-152和AT1R靶向结合关系。结果:AngⅡ刺激能够促进心肌成纤维细胞增殖,上调成纤维细胞中胶原蛋白Collagen I和Collagen Ⅲ的表达,同时能够抑制mi R-152的表达,促进AT1R m RNA和蛋白的表达。在AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞中,过表达mi R-152或沉默AT1R均能够上调细胞增殖活力,促进胶原合成。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示AT1R是mi R-152靶基因,mi R-152能够负向调控AT1R的表达。在AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞中,同时过表达mi R-152和AT1R能够逆转单独过表达mi R-152导致的细胞增殖抑制作用,回调胶原蛋白Collagen I和Collagen Ⅲ合成抑制作用。结论:mi R-152能够抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,其作用机制可能是通过靶向AT1R的表达实现的。     

大鼠正中视前核注射血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)对某些肾脏功能指标的影响

目的：探讨大鼠正中视前核注射血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）对某些肾脏功能指标的影响。方法：健康雄性SD大鼠56只随机分为4组（n=14）：①人工脑脊液组：正中视前核（MnPO）先注射人工脑脊液（aCSF）0.25 μl,20 min后再注射0.25 μl,②血管紧张素Ⅱ组：MnPO先注射aCSF 0.25μl,20 min后再注射内含20 ng血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）溶液0.25μl,③洛沙坦预处理组：MnPO先注射内含5μg洛沙坦（Losartan）溶液0.25μl,20 min后再注射20 ng血管紧张素Ⅱ溶液0.25μl,④洛沙坦组：MnPO先注射内含5μg洛沙坦溶液0.25μl,20 min后再注射aCSF 0.25μl。每组取7只大鼠在注射前、注射后20 min、40 min、60 min、120 min检测尿钠浓度,另7只大鼠注射1 h后处死动物,取肾脏,检测各组大鼠肾组织一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性。结果：52只大鼠进入结果分析,与人工脑脊液组相比,血管紧张素Ⅱ组肾脏NO与NOS活性升高,1 h肾排钠量明显升高;与洛沙坦预处理组相比,血管紧张素Ⅱ组肾脏NO与NOS活性升高,1 h肾排钠量也明显升高。结论：AngⅡ作用于MnPO后,肾促钠排泄反应增强,肾皮质NO水平升高,NOS活性增强,洛沙坦预处理可下调AngⅡ在肾脏诱导的上述变化。     

TGF-β1在应力介导的牙周膜成纤维细胞增殖中的作用及其机制

目的:探讨周期性张应力作用下人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)转化生长因子β1(TGF-β1)对其细胞增殖的作用,及对其I型胶原基因表达的作用和影响.方法:在成功构建人牙周膜成纤维细胞体外培养力学刺激模型的基础上,利用多通道细胞牵张应力加载系统,对细胞分别施加2、6、12与24 h的周期性张应力,以不加力组为对照组,观察各组细胞形态变化,利用细胞计数试剂8检测细胞增殖活性,并利用ELISA试剂盒检测加力后各组TGF-β1的表达,并对加力12h组加入TGF-β1抑制剂SB431542,利用RT-PCR检测技术检测对I型胶原基因表达的影响.结果:与对照组比较,加力2h细胞增殖稍降低,6h增殖活性增强,12h达到峰值,24h增殖活性明显受到抑制;TGF-β1的表达与细胞增殖成正相关;TGF-β1受到抑制后细胞增殖受到影响,I型胶原的表达也受到影响.结论:人牙周膜成纤维细胞的增殖在一定时间的周期性张应力作用下先增加然后再抑制,其中TGF-β1参与细胞增殖,并且TGF-β1对人牙周膜成纤维细胞I型胶原的表达起促进作用.