远端上游元件结合蛋白1的生物学功能

远端上游元件结合蛋白1（far upstream element binding protein 1, FUBP1）通过特异性结合远端上游元件（upstream element, FUSE）调控原癌基因c-Myc的转录。FUBP家族包括FUBP1、FUBP2、FUBP3及FUBP4,其序列具有高度同源性,但功能各不相同。FUBP1蛋白由3个结构域构成,具有两亲性螺旋结构的N端、富含酪氨酸的C端以及1个DNA结合区域。生理状态下,FUBP1蛋白定位于细胞核。除了调控c-Myc转录外,FUBP1还可结合RNA,参与调控mRNA稳定性、病毒复制及RNA的剪接。     

Molecular Characterization of the Mouse Tyrosinase Gene:Pigment Cell-Specific Expression in Transgenic Mice

Tyrosinase is the key enzyme in melanin synthesis, and is expressed in the pigment epithelium of the retina, a cell layer derived from the optic cup; and in neural crest-derived melanocytes of skin, hair follicle, choroid, and iris. The tyrosinase gene has been cloned and shown to map to the well-characterized c-locus (albino locus) of the mouse. Subsequent studies demonstrated that a functional tyrosinase minigene was able to rescue the albino phenotype in transgenic mice. The transgene was expressed in a cell type-specific manner in skin and eye. During development of the mouse, the tyrosinase gene is expressed in the pigment epithelium of the retina as early as day 10.5 of gestation. In the hair follicle, tyrosinase gene expression is detected from day 16.5 onwards. This cell-type–specific expression is largely reproduced in transgenic mice. Our results suggest that sequences in the immediate vicinity of the mouse tyrosinase gene are sufficient to provide cell type-specificity and developmental regulation in melanocytes and the pigment epithelium.     

人类不同类型细胞中X-盒结合蛋白1转录活性研究

人类X-盒结合蛋白1(X-box binding protein1,XBP1)作为一种重要的转录因子,在细胞中涉及了广泛的信号调控过程。为进一步研究XBP1的生物学功能,首先利用生物信息学技术确定XBP1基因的启动子区域和2个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应扩增XBP1启动子和2个缺失突变体的基因序列,分别克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建3个报告载体p1-XBP1p、p2-XBP1p和p3-XBP1p,确定启动子活性最强的序列,并以该序列分别转染正常人肝细胞L02、人肝母细胞瘤细胞HepG2、人肝癌细胞SMMC-7721、人类红白血病细胞K562、人皮肤成纤维细胞HSF和人贮脂细胞Lipocyte Ito Cell 6种不同类型的细胞后(FuGENE 6 transfection reagents),CAT-ELISA方法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)在不同细胞系中的表达活性。每一组CAT结果反应了XBP1启动子转录活性的大小,其中p3-XBP1p在HepG2细胞中活性最强,是pCAT3-Basic的12.4倍,其次是K562和SMMC-7721,分别是10.9倍和10.0倍;在L02细胞中CAT酶活性低于上述3种异常细胞,在HSF和Ito细胞中CAT酶活性低或没有活性。运用适时荧光PCR方法和免疫印迹分别从mRNA水平和蛋白水平检测了XBP1在不同细胞中的表达情况,结果均显示XBP1在HepG2、K562和SMMC-7721细胞中的转录和表达强于L02、HSF和Ito细胞,在HSF细胞和L02细胞中转录和表达较低,在Ito细胞中几乎检测不到XBP1的表达,与CAT-ELISA检测结果一致。因此,XBP1启动子的转录活性在不同细胞中是具有差异的,而XBP1启动子转录活性的大小直接调控下游基因XBP1的表达,导致不同细胞中XBP1的表达丰度也不相同,XBP1启动子的转录活性和表达与细胞类型、细胞周期和组织特异性密切相关。本研究发现XBP1启动子的ATG上游-227bp～66bp区域与XBP1的转录活性密切相关,属于XBP1启动子的核心区域;进一步比较XBP1基因核心启动子区在不同细胞中转录活性的差别和XBP1基因表达丰度的差异,为揭示真核细胞中XBP1的转录调控机制奠定基础。     

棉花脱水应答元件(DRE)结合蛋白GhDBP1的原核表达、纯化及其DNA结合活性

棉花是一种重要的经济作物,其生产和产量要受到干旱、低温和高盐等环境胁迫的影响,因此提高棉花对这些胁迫的抗性非常重要.脱水应答元件(DRE-dehydrationresponsiveelement)结合蛋白(DBP)在调节植物对环境胁迫的抗性中起到非常重要的作用.而且过量表达DBP类基因的转基因植株能够很好抵抗这些环境胁迫,所以研究棉花中此类DRE元件结合蛋白对棉花生产有非常重要的意义.在以前的工作中,从棉花中分离一个DBP基因,命名为GhDBP1并在转录水平上分析它在棉花植株中的表达特征.在研究中,报道了GhDBP1的原核表达、纯化和它的DNA结合特性.GhDBP1基因的编码区用PCR技术扩增出来插入到原核表达载体pET28a中,并转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中.经过IPTG诱导,GhDBP1融合蛋白在BL21(DE3)菌株中成功进行表达.利用Ni-NTA亲和层析技术得到了纯化的融合蛋白.在非同位素的凝胶滞留实验中,纯化的GhDBP1融合蛋白能够结合到含有DRE元件的DNA片段上.另外,用SWISS-MODEL软件对GhDBP1蛋白的DNA结合区的三维结构进行了计算机模拟.模拟的结果显示,GhDBP1蛋白的DNA结合区的主链结构和折叠模式与已知的拟南芥GCC盒结合蛋白AtERF1的DNA结合区结构很相似.这些结果显示了GhDBP1是一个脱水应答元件(DRE)结合的转录因子,并可能运用与AtERF1的DNA结合区相似的结构和它的目标序列脱水应答元件(DRE)相结合.     

Identification and Functional Validation of a 5′ Upstream Regulatory Sequence in the Human Tyrosinase Gene Homologous to the Locus Control Region of the Mouse Tyrosinase Gene

Comparison analysis of the sequences of the mouse and human genomes has proven a powerful approach in identifying functional regulatory elements within the non‐coding regions that are conserved through evolution between homologous mammalian loci. Here, we applied computational analysis to identify regions of homology in the 5′ upstream sequences of the human tyrosinase gene, similar to the locus control region (LCR) of the mouse tyrosinase gene, located at ?15 kb. We detected several stretches of homology within the first 30 kb 5′ tyrosinase gene upstream sequences of both species that include the proximal promoter sequences, the genomic region surrounding the mouse LCR, and further upstream segments. We cloned and sequenced a 5′ upstream regulatory sequence found between ?8 and ?10 kb of the human tyrosinase locus (termed h5′URS) homologous to the mouse LCR sequences, and confirmed the presence of putative binding sites at ?9 kb, homologous to those described in the mouse tyrosinase LCR core. Finally, we functionally validated the presence of a tissue‐specific enhancer in the h5′URS by transient transfection analysis in human and mouse cells, as compared with homologous DNA sequences from the mouse tyrosinase locus. Future experiments in cells and transgenic animals will help us to understand the in vivo relevance of this newly described h5′URS sequence as a potentially important regulatory element for the correct expression of the human tyrosinase gene.     

人钙周期蛋白结合蛋白（hCacyBP）基因的克隆与表达

筛选cDNA文库得到了人的钙周期蛋白结合蛋白基因 ,将此基因的全编码区克隆到原核表达载体pET2 8上 ,诱导目的蛋白质表达以后将重组蛋白质用亲和层析的方法进行纯化 ,得到了纯度很好的重组的目的蛋白质 ,以此作为抗原免疫动物 ,得到抗钙周期蛋白结合蛋白的特异多克隆抗体。Western印迹的结果表明 ,该基因在小鼠多种组织中广泛表达 ;免疫组化的结果表明 ,BT32 5细胞诱导分化后钙周期蛋白结合蛋白分布有变化 ,由分布于胞质中转向分布于胞核和核周胞质     

鲈鱼酰基辅酶A结合蛋白Acbp基因cDNA的克隆和诱导表达

酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding protein,ACBP)对长链脂酰基辅酶A(long-chainfatty acyl-CoA esters,LCACoA)有很高的亲和力,因而对LCACoA在细胞内的运输和利用过程起重要的作用。本文采用RACE技术从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp基因的全长cDNA序列,该基因全长cDNA 679 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为83 bp和326 bp,开放阅读框为270 bp。推测编码89个氨基酸,理论等电点为5.44,分子量为10.14 kDa。鲈鱼Acbp与青鳉鱼、银鳕鱼、大西洋鲑和人的同源性分别为87%、84%、78%和68%。用RT-PCR和实时定量PCR检测鲈鱼肌肉、心脏、眼、大脑、消化道、肾脏、脂肪组织、脾脏、鳃和肝脏等10种组织的Acbp基因的表达情况,结果表明,在肾脏和肝脏的表达量高,肌肉、眼睛和大脑中表达低。定量PCR检测表明鲈鱼肝脏Acbp的表达在饥饿时明显下降,胰岛素上调其表达,葡萄糖对其表达则没有影响。     

心脏特异性高表达hAPE1基因小鼠的构建与鉴定

本研究拟建立心脏特异性表达hAPE1转基因小鼠,为研究hAPE1基因功能及其突变与心脏发育和心血管疾病的关系提供工具动物。将人APE1(human APE1,hAPE1)基因插入到心脏特异性启动子α-肌球蛋白重链(α-MHC)下游,构建了心肌细胞特异性表达hAPE1的转基因表达载体,显微注射法导入C57BL/6J小鼠受精卵中,经胚胎移植获得转基因首建者小鼠,建立hAPE1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,Western blotting鉴定h APE1蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系。研究表明,将含有心肌细胞特异性α-MHC启动子和hAPE1基因的转基因载体进行显微注射于小鼠胚胎中,接着将胚胎移植入假孕母鼠的输卵管中发育,建立了心脏组织特异性高表达hAPE1转基因小鼠品系,获得子代小鼠40只。PCR检测发现有15只小鼠在其基因组上整合有hAPE1基因,Western blotting检测hAPE1在这些小鼠心脏中高度特异性表达。本研究成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达hAPE1的转基因小鼠,为研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体

前期通过染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay,CHIP）筛选出了转录因子activator protein．2 alpha（AP-2α）的靶基因Sumf1．采用重叠延伸PCR定点诱变技术,对AP．2α在Sumf1内含子片段上的两个结合位点的碱基进行定点突变,并构建定点突变表达载体．DNA测序表明,Sumf1内含子片段103—111bp,411～419bp两处的碱基已分别由GCCGTCAGG突变为GAAGTCCTG,由GCCTCTAGG突变为GGATCTCTG,成功实现定点诱变,为进一步研究AP-2α对基因Sumf1的表达调控奠定了基础．     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能     

水稻生长素结合蛋白ABP1的原核表达及纯化

生长素结合蛋白能够与生长素特异性结合,因而有可能直接被用作生长素免疫分析和生物传感测定中的高特异性、高亲和力识别分子.本研究通过RT-PCR获得水稻生长素结合蛋白1(ABP1)cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a-ABP1 重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性...     

不同品种实验兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表达量的变化

目的从酪氨酸酶基因序列和表达量两个方面探讨酪氨酸酶与家兔虹膜颜色表型的关系。方法通过PCR扩增和测序检测4个具有不同颜色性状的家兔品种的酪氨酸酶基因外显子序列多态性;通过荧光定量PCR检测酪氨酸酶基因表达水平。结果白化品种日本大耳白兔和獭兔的TYR基因序列在第1118个碱基处都由C突变为A,并导致编码蛋白在373位,即最后一个N-糖基化位点发生由Thr到Lys的突变。白毛黑眼兔和青紫兰兔在第870个碱基处全部发生由A到T的无义突变。在白毛黑眼兔种群的所有个体和獭兔种群的部分个体中都发现TYR基因序列在第91个碱基处发生G到A的突变,导致氨基酸序列第31位处Val到Met的变异。经内参基因GAPDH的校正,TYR基因在白毛黑眼兔和青紫兰兔中表达水平显著高于在日本大耳白兔和獭兔中的表达水平（P〈0.01）。而在白毛黑眼兔和青紫兰兔之间、日本大耳白兔和獭兔之间,TYR基因的表达差异没有显著性。结论家兔TYR基因突变可能大幅度降低TYR基因表达,导致酪氨酸酶功能低下,从而影响虹膜颜色表型。     

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2~3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

丙型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒 ,其基因组长约 9.5Ｋｂ ,编码区含一个大开放读码框架 ,编码 30 1 0 30 33氨基酸残基的多蛋白前体 ,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。ＨＣＶ各区域的分布顺序是 :Ｃ Ｅ1 Ｅ2 ｐ7 ＮＳ2 ＮＳ3 ＮＳ4Ａ ＮＳ4Ｂ ＮＳ5Ａ ＮＳ5Ｂ[1] 。本文我们应用ＲＴ ＰＣＲ方法从ＨＣＶ患者血清中扩增编码病毒蛋白酶的非结构蛋白 (ＮＳ2 ＮＳ3)部分基因 ,对其核苷酸序列进行了分析 ,…     

大鳞副泥鳅和泥鳅GNB2L1基因的克隆、表达及系统进化分析

由G蛋白β2亚基类似物1基因(GNB2L1)编码的蛋白激酶C受体(RACK1)是一个高度保守的锚定蛋白,属于WD40结构域蛋白家族成员,在细胞信号转导等生命过程中发挥着重要作用。本文采用RACE技术和基因克隆技术分别对大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)精巢组织的GNB2L1基因c DNA序列进行了克隆。序列分析表明,大鳞副泥鳅GNB2L1基因c DNA序列全长1 115 bp,开放阅读框(ORF)长965 bp,编码317个氨基酸;泥鳅GNB2L1基因c DNA序列的开放阅读框长965 bp,编码317个氨基酸;两种泥鳅GNB2L1基因编码的蛋白与其他鱼类的RACK1蛋白的同源性为94%~97%,且不同进化地位物种的GNB2L1基因均由8个外显子和7个内含子组成。以GNB2L1基因为标记基因,构建的鱼类系统发育树显示,大鳞副泥鳅和泥鳅在进化上的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,GNB2L1基因在大鳞副泥鳅成体各组织中均有表达,且在脑组织的表达量高于其他组织。以上结果表明,GNB2L1基因为一个进化保守基因,可能在大鳞副泥鳅的细胞活动中发挥着重要作用。     

参与小鼠神经发育的mCcd1基因的组织表达

介绍了一种可能在神经发育过程中起重要调节作用的基因mCcd1在小鼠发育过程中的mRNA和蛋白质水平的表达变化。通过对新生和成年小鼠多组织免疫杂交(Western Blot)和反转录PCR(RT-PCR)检测发现:该基因在多种组织中广泛表达,但脑部显示高表达,并且新生鼠各组织表达均高于成体。小鼠11.5 d胚胎切片免疫组化实验也支持这一结果。mCcd1在神经系统发育早期的表达暗示它可能参与了神经系统的发育过程。     

电穿孔介导的人对氧磷酶1基因在小鼠原代骨骼肌细胞中的转移与表达

非病毒载体介导的外源基因在哺乳动物骨骼肌细胞中的表达往往受限于基因转移效率的低下.本文利用电穿孔为基因转移方法,研究了人对氧磷酶基因（PON1）在原代培养的小鼠骨骼肌成肌细胞和成熟肌管中的转移与表达.在上述细胞中加入PON1的真核表达质粒后实施一定条件的电穿孔,通过测定不同时间点培养基与细胞裂解液中芳香酯酶活性的变化以衡量PON1的表达与分泌.结果显示,PON1在成肌细胞中表达的最佳电穿孔条件为800 V/cm, 20 ms and 50 μF;在肌管中为700 V/cm, 20 ms and 50 μF.在此条件下,细胞存活率均达75%以上,且表达的蛋白均可有效分泌.RT PCR分析同样验证了PON1 mRNA在骨骼肌细胞中的高效表达.电穿孔介导的PON1基因表达效率显著高于传统的基因转移方法如磷酸钙法和阳离子脂质体法.因此,以不同分化阶段的骨骼肌细胞为靶细胞,通过电穿孔介导外源基因表达切实可行,并可能在细胞工程与基因治疗等领域均具有潜在的应用前景.     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .