辐射诱导转录子RIGb cDNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

核酸序列同源性分析和RT -PCR确定辐射诱导转录子RIGb是染色质重构基因CHD6表达的一个剪接转录子.Northern杂交结果表明,0 . 5Gyγ射线诱导RIGbmRNA表达增加,但4Gy大剂量照射对其表达无明显的影响.正常成人组织Northern杂交结果显示,RIGb基因在心脏、肝脏和睾丸中有高表达.细胞生长曲线分析结果表明,转染和稳定表达RIGb的人宫颈癌细胞(HeLa)的增殖生长受到明显抑制,细胞周期分析发现G1/S期阻滞.     

CHD4在染色体重塑中的作用

染色质作为真核细胞遗传信息,体内外各种因素的作用致使不断的产生损伤,但是细胞仍能保持正常的生长、分裂和繁殖,这与基因组稳定性和完整性保持,并且通过自身的损伤修复有着密切的联系。ATP依赖的染色质重塑是染色质重塑的最重要的方式之一,主要是利用ATP水解释放的能量,将凝聚的异染色质打开,协调损伤修复蛋白与DNA损伤位点的作用,通过对组蛋白的共价键修饰或ATP依赖的染色质重塑复合物开启了DNA的损伤修复的大门。CHD4/Mi-2β的类SWI2/SNF2 ATP酶/解螺旋酶域结构域保守性最强,这一结构域存在与多种依赖于ATP的核小体重构复合物。Mi-2蛋白复合物称为核小体重塑及去乙酰化酶NuRd(nucleoside remodeling and deacetylase,NuRD),是个多亚基蛋白复合物,Mi2β/CHD4是该复合物的核心成员。近来的研究发现,CHD4具有染色质重塑功能,并且参与DNA损伤修复的调控。CHD4羧基端的PHD通过乙酰化或甲基化识别组蛋白H3氨基端Lys9(H3K9ac和H3K9me),并且通过Lys4甲基化(H3K4me)或Ala1乙酰化(H3A Lac)抑制与H3、H4的结合,为染色质重塑提供了保障。Mi-2β/CHD4参与DNA损伤反应,定位于DNA损伤γ-H2AX的foci。沉默Mi-2β/CHD4基因,细胞自发性DNA损伤增多和辐射敏感性增强。表明CHD4在染色质重塑中具有重要的作用。     

TAB182对电离辐射诱发细胞周期G2/M阻滞的调节作用

TAB182是一个端锚聚合酶1（tankyrase 1）结合蛋白,它在体外能够被tankyrase 1发生二磷酸腺苷核糖基化(PAR)修饰,其生物学功能目前尚不明确.本研究发现,TAB182蛋白水平受电离辐射诱导表达,HeLa细胞经过4 Gy照射处理时,TAB182在2 h表达含量最高; 经过不同剂量照射处理,2 h后2 Gy、4 Gy照射剂量组HeLa细胞中TAB182的表达有明显增加. 通过shRNA沉默HeLa细胞中TAB182基因表达,导致其对4 Gy及以下剂量 辐射的敏感性增加,但对8 Gy大剂量照射的敏感性没有明显变化. 与对照组相比,4 Gy照射诱发TAB182基因沉默细胞的G2/M期阻滞时间显著延长.抑制TAB182表达导致细胞中DNA损伤反应蛋白DNA PKcs、ATM、Chk2的表达水平显著降低. 实验结果提示,TAB182蛋白参与放射DNA损伤信号反应和调控细胞周期G₂/M进程.     

抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

组蛋白H3/H4的分子伴侣Asf1(anti-silencing factor 1),参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配,同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程. 在不同生物中,Asf1具有功能的保守性和多样性．嗜热四膜虫ASF1（TTHERM_00442300）基因编码的蛋白质含有保守的N端结构域和酸性的C端结构域．N端结构域同源序列进化树分析表明,Asf1进化与物种进化一致．实时荧光定量PCR表明,ASF1在四膜虫营养生长、饥饿及有性生殖时期均有表达,且在有性生殖4～6 h转录水平达到最高．免疫荧光定位分析表明,HA-Asf1在营养生长时期以及有性生长时期定位于功能大核和小核中,而在凋亡的大核中信号消失．过表达ASF1导致大核及小核变大,抑制细胞增殖．敲减ASF1后会导致大核形态异常,小核缺失．结果表明,ASF1表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用．     

染色质改构因子BRG1降低UV照射引起的细胞凋亡

生命体的遗传物质基础是DNA分子,多种因素可以作用于细胞内的DNA分子,导致多种类型的DNA损伤。若受损的DNA得不到及时和有效的修复,细胞将走向凋亡或发生变异。染色质改构复合物(chromatin remodeling complex)在基因表达调控和DNA复制等方面扮演着重要角色。依赖ATP的染色质改构复合物SWI/SNF的核心亚基Brahma Related Gene1(BRG1)在染色质结构调整和基因转录调控等多个细胞进程中具有重要作用,仅有有限的文献报道BRG1参与到DNA的损伤修复过程。因此,进一步研究与验证BRG1在调控DNA的损伤修复进而挽救细胞凋亡中的作用十分重要。本文通过利用不同强度的UV照射检测细胞凋亡的情况,初步建立了DNA损伤修复的实验体系。将BRG1表达质粒瞬时转染到SW13(BRG1-/-)细胞系中,并利用30J/m2的UV照射,分别在0h、6h和24h检测细胞早期凋亡程度。结果表明,SW13(BRG1-/-)细胞中瞬时表达BRG1可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡,其中UV照射后24h的细胞表现最明显。我们进一步在HeLa细胞中通过瞬时表达BRG1验证了上述结果。由于BRG1通过染色质改构在基因的转录调控、复制和重组等方面起着重要的作用,我们推测BRG1可能通过染色质改构参与了DNA的损伤修复过程,进而影响了细胞凋亡。     

溴结构域蛋白4的结构和功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain, Bet)家族是表观基因组的调节因子,也是肿瘤细胞生存所依赖的肿瘤相关基因表达的关键驱动因子。溴结构域蛋白4 (bromodomain-containing protein 4, Brd4)是溴域和端外蛋白家族中的一员,通常识别乙酰化组蛋白,并定位于目的基因的启动子或增强子区域,启动并维持肿瘤相关基因的表达。Brd4与多种转录因子调控和染色质修饰密切相关,并参与DNA损伤修复、维持端粒功能,从而维持肿瘤细胞的存活。本文围绕Brd4蛋白的结构、功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用进行综述。     

人类高度进化保守基因hnulp1中转录抑制区段的定位

hnulp1是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的新的一类转录因子.其C端含一个DUF654结构域,其序列在同源基因中相当保守,但该结构域功能未知.利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域(DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4-Luc)质粒,构建了哺乳动物细胞转录因子活性分析系统,随后利用GAL4-Luc荧光素酶报告基因对5种含DUF654结构域的不同缺失片段转录抑制活性进行检测.检测结果表明,该基因DUF654结构域中从Δ228-407氨基酸区段具有强烈的转录抑制活性.该结果为进一步研究DUF654结构域的功能和hnulp1基因转录调控的机制奠定了基础.     

一种基于GFP分子荧光显示的检测大尺度染色质松弛技术的建立

在真核生物中,基因组DNA是被高度包装成染色质的形式而存在的,这就对基因在复制、转录、修复、重组时的功能分子有效地接近DNA形成了天然屏障,执行上述生化反应需要松散染色质的结构,染色质松散是染色质动态变化即染色质重塑(chromatin remodeling)的一种形式.越来越多的证据表明,染色质重塑在DNA损伤反应中起着非常重要的作用,染色质重塑过程可以把损伤应答和修复蛋白募集到损伤位点,从而完成修复.为了进一步探讨染色质重塑和DNA损伤修复的偶联机制,采用了基于Lac抑制子和Lac操纵子的大规模染色质重塑报告系统,并借助GFP分子荧光显示方法,建立了可以直观地观察染色质松散的技术.在利用该技术证实了DNA损伤应答蛋白TIP60能够强烈诱导染色质松散的基础上,发现P53诱导基因3蛋白(PIG3)在细胞辐射DNA损伤反应中也能够一定程度地诱导染色质松弛.这些结果证明此技术是可靠的,也为阐述DNA损伤修复与染色质重塑关联机制提供了新的信息.     

滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。     

2012年第6期《遗传》封面说明

表观遗传是指非DNA突变的可遗传表型。从分子水平上来说,表观遗传是因染色质的修饰或构象变化而引起的基因表达变化。SWI/SNF染色质重塑复合体即是表观遗传分子机制中的重要一员;SWI/SNF复合体依赖ATP水解的能量打开核小体结构,使转录因子可以接近DNA,从而有利于转录调节。SWI/SNF复合体核心组分INI1/hSNF5负责与多种转录调节蛋白结合。这些转录调节因子有些是重要的原癌蛋白,如c-myc、ALL1、核抗原2和GADD43等;也有重要     

Differential expression of oxidative stress and extracellular matrix remodeling genes in low- or high-dose-rate photon-irradiated skin

Changes in the expression of genes implicated in oxidative stress and in extracellular matrix (ECM) remodeling and selected protein expression profiles in mouse skin were examined after exposure to low-dose-rate or high-dose-rate photon irradiation. ICR mice received whole-body γ rays to total doses of 0, 0.25, 0.5 and 1 Gy at dose rates of 50 cGy/h or 50 cGy/min. Skin tissues were harvested for characterization at 4 h after irradiation. For oxidative stress after low-dose-rate exposure, 0.25, 0.5 and 1 Gy significantly altered 27, 23 and 25 genes, respectively, among 84 genes assessed (P < 0.05). At doses as low as 0.25 Gy, many genes responsible for regulating the production of reactive oxygen species (ROS) were significantly altered, with changes >2-fold compared to 0 Gy. For an ECM profile, 18-20 out of 84 genes were significantly up- or downregulated after low-dose-rate exposure. After high-dose-rate irradiation, of 84 genes associated with oxidative stress, 16, 22 and 22 genes were significantly affected after 0.25, 0.5 and 1 Gy, respectively. Compared to low-dose-rate radiation, high-dose-rate exposure resulted in different ECM gene expression profiles. The most striking changes after low-dose-rate or high-dose-rate exposure on ECM profiles were on genes encoding matrix metalloproteinases (MMPs), e.g., Mmp2 and Mmp15 for low dose rate and Mmp9 and Mmp11 for high dose rate. Immunostaining for MMP-2 and MMP-9 proteins showed radiation dose rate-dependent differences. These data revealed that exposure to low total doses with low-dose-rate or high-dose-rate photon radiation induced oxidative stress and ECM-associated alterations in gene expression profiles. The expression of many genes was differentially regulated by different total dose and/or dose-rate regimens.     

γ射线对人淋巴细胞cx43和ANLN基因转录表达的影响

目的研究γ射线对人外周血淋巴细胞cx43和ANLN基因转录表达的影响。方法对数生长期的淋巴细胞,分别给予1、2、3、4、5、6 Gy的^60Coγ射线照射,照射后12h,以及2Gy照射后4、8、12、24、36、48、72h,分别提取总RNA,反转录成cDNA。利用实时荧光定量PCR技术,检测各组cx43和ANLN基因表达改变。结果人外周血淋巴细胞cx43 mRNA表达水平在2Gy照射后4、8、12h明显增高,分别为对照组（未照射组）的6．74、9．06、7．22倍（P〈0．05）;24～72h,其表达水平与对照组相比没有明显变化。1、2、3、4、5、6Gy剂量照射后12h,cx43 mRNA表达水平显著增高（P〈0．05）。ANLN mRoNA表达水平在2Gy不同时间点及1～5Gy照射后12h,表达降低（P〈0．05）,6Gy照射后12h其表达开始升高,为对照组的6．08倍（P〈0．05）。结论γ射线照射2Gy不同时间点及不同剂量照射后12h,cx43基因表达上调,ANLN基因表达下调。1～3Gy剂量照射后12h,cx43 mRNA表达在此范围内有时间和剂量的依赖性。cx43可能会发展为核事故受照射人员的分子生物学剂量标记物。     

Survivin expressions in human hepatoma HepG2 cells exposed to ionizing radiation of different LET

Survivin is a member of the inhibitors of apoptosis (IAP) protein family that interferes with post-mitochondrial events including activation of caspases. To examine the regulation of survivin expression in response to irradiation with different linear energy transfer (LET), human hepatoma HepG2 cells were irradiated in vitro with X-rays and carbon ions. Cellular sensitivities to low- and high-LET radiation were determined by colony formation. Survivin expression at mRNA and protein level were measured with RT-PCR and Western blot analyses, respectively. Radiation-induced cell cycle arrest and apoptosis were investigated with flow cytometry. We found that low-LET X-rays induced dose-dependent increases in survivin expression. After exposure to high-LET carbon ions, survivin expression gradually increased from 0 to 4 Gy, and then declined at 6 Gy. More pronounced survivin expression, stronger G(2)/M phase arrest was observed after exposure to carbon ions in comparison with X-rays at doses from 0 to 4 Gy. These observations indicate that there is a differential survivin expression in response to different LET radiations and the cycle arrest mechanism may be associated with it. In addition, our data on induction of apoptosis are compatible with the assumption that survivin expression induced by low-LET X-rays radiation may play a critical role in inhibiting apoptosis. However, after irradiation with ions, an anti-apoptotic function of survivin is not evident, possibly because of the serious damage produced by densely ionizing radiation.     

Dose-rate effect on the induction of HPRT mutants in human G0 lymphocytes exposed in vitro to gamma radiation

The influence of dose rate on expression time, cell survival and mutant frequency at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) locus was evaluated in human G(0) peripheral blood lymphocytes exposed in vitro to gamma rays at low (0.0014 Gy/min) and high (0.85 Gy/min) dose rates. A cloning assay performed on different days of postirradiation incubation indicated an 8-day maximum expression period for the induction of HPRT mutants at both high and low dose rates. Cell survival increased markedly with decreasing dose rate, yielding D(0) values of 3.04 Gy and 1.3 Gy at low and high dose rates, respectively. The D(0) of 3.04 Gy obtained at low dose rate could be attributed to the repair of sublethal DNA damage taking place during prolonged exposure to low-LET radiation. Regression analysis of the mutant frequency yielded slopes of 12.35 x 10(-6) and 3.66 x 10(-6) mutants per gray at high and low dose rate, respectively. A dose and dose-rate effectiveness factor of 3.4 indicated a marked dose-rate effect on the induced HPRT mutant frequency. The results indicate that information obtained from in vitro measurements of dose-rate effects in human G(0) lymphocytes may be a useful parameter for risk estimation in radiation protection.     

低水平辐射诱导的细胞遗传学适应性反应

先用0.01GY x-射线(剂量率:0.01GY/分)体外照射人、兔外周血,经不同时间后再用1.5GY X-射线(0.44GY/分)照射,发现在G_0、G_1、S和G_2期受0.01GY X-射线照射后再给大剂量照射者,其染色体畸变率明显低于单纯受1.5GY X-射线照射组(P<0.01)。这一适应性反应能持续3个细胞周期,在接受小剂量照射后超过3个细胞周期再受大剂量照射者,染色体畸变率未见减少。若在第三细胞周期以后再次给予小剂量照射,可再次诱导适应性反应。用小鼠整体小剂量照射后骨髓细胞和生殖细胞亦出现这种适应性反应。另外也探讨了不同剂量和不同剂量率的预先照射对适应性反应的影响。