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目的:利用毕赤酵母野生型菌株GS115(his4)和突变型菌株GJK01(ura3,adel,arg4,his4,ochl)表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF),并对其活性及糖基修饰情况进行比较.方法:用PCR技术扩增目的基因,引入Xho I、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析.结果:hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79x105和2.21x10s U/mL.结论:利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型. 相似文献
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TransgenicResearch 2 0 0 2年 1 0月 1 1卷 5期 5 2 1~ 5 31页报道 :种子不仅是高等植物延续生命的重要材料 ,也是人类食物、药品和工业原料的重要来源。近年来已将不同来源包括人类、细菌和病毒的可利用的基因序列表达于植物 ,也试图利用转基因种子蛋白来生产药物。已知人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)在调节白血细胞 (粒细胞和单核细胞 )的生成和功能中可发挥重要作用 ,在抗感染中具有重要的临床意义。还发现GM CSF在化疗、骨髓移植、抗癌和抗艾中也具有多种临床应用。因此 ,目前已有一些国家将重组GM CSF用于临床治疗… 相似文献
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大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达99%,按蛋白总量计算回收率达10%,比活性达1×10^7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端1 相似文献
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对重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—csF)高效表达克隆pzw.GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的人GM—CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM—CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99%,按蛋白总量计算回收率达10%,比活性达1×107/mg蛋白质。通过测定纯化人GM—csF的N端l 6个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氮基酸序列完全一致,为大批量重组人GM—CSF的生产创造了条件。 相似文献
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人巨噬细胞集落刺激因子在家蚕中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
人巨噬细胞集落刺激因子在家蚕中的高效表达秦浚川,邱平,施晓青,朱洁,朱德煦(南京大学生物化学系,国家医药生物技术重点实验室,210008)关键词人巨噬细胞集落刺激因子;家蚕;基因表达人巨噬细胞集落刺激因子(hM-OSF)是一种重要的血细胞生长因子,它... 相似文献
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粒细胞巨噬细胞集落刺激因子诱导的巨噬细胞外向K+电流的特性 总被引:1,自引:1,他引:0
以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,16ng/ml)长期(0.5-6d)刺激小鼠腹腔渗了的巨噬细胞,采用全细胞膜片箝技术研究在GM-CSF刺激过程中细胞膜电流的变化,观察到一种GM-CSF诱导的瞬间失活的外向K电流,该电流在生理电压范围内可发生稳态失活,且当施加0.5HZ的去极化脉冲刺激时其失活具有频率依赖性。该电流对胞外4-AP高度敏感,胞内Ca^2+浓度「Ca^2+」升主可抑制其幅度, 相似文献
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血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelialgrowthfac tor,简称VEGF)是一类多功能细胞因子 ,特异地作用于血管内皮受体KDR和Flt 1,促进新生血管形成并增加微血管的渗透性[1] 。VEGF在生理和病理 ,如肿瘤血管发生、伤口愈和、类风湿性关节炎、胚胎发育及冠心病等过程中起着非常重要的作用。天然VEGF是由两条糖蛋白链形成的二聚体。目前发现VEGF至少有 5种亚型 ,根据单体残基数不同分别为VEGF12 1,VEGF14 5,VEGF165,VEGF189和VEGF2 0 6,其中VEGF12 1和VEG… 相似文献
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毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用 总被引:9,自引:1,他引:9
巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。 相似文献
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目的:建立一种简单、快速复性并同时纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的方法。方法:研究rhGM-CSF在疏水色谱(HIC)上的复性和纯化机理,并对固定相和流动相进行选择和优化,包括固定相配基、流动相中盐的种类、流动相pH值、流动相中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比例,以及流动相中尿素的浓度。结果:优化后的固定相为PEG600,流动相中的盐为(NH4)2SO4,流动相pH值为7.0,流动相中添加2.0mol/L尿素、1.8mmol/LGSH和0-3mmol/LGSSG。在优化条件下,HIC可使rhGM-CSF在分离纯化的同时得到复性,比活达1.58×10^7U/mg,纯度为95.7%,质量回收率为56.8%。结论:建立的疏水色谱复性和纯化工艺可简化操作步骤,缩短生产周期。 相似文献
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人内皮细胞抑制生长素在毕赤酵母中的高效表达 总被引:2,自引:0,他引:2
根据人胶原蛋白ⅩⅧNC结构域C末端编码内皮细胞抑制生长素 (Endostatin)的成熟多肽序列 ,人工合成了由毕赤酵母 (Pichiapastoris)中偏爱密码子组成的内皮细胞抑制生长素基因序列。该基因以N端融合的方式正确插入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电激将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1 1 68细胞中 ,筛选获得表达具有生物活性的内皮细胞生长抑制素的高产菌株。在摇瓶发酵水平上 ,产量达到 80mg L。而利用生物反应器进行高密度发酵 ,Endostatin的产量可达 1 2 5mg L。纯化后的Endostatin具有抑制小鼠血管内皮细胞增殖的活性 相似文献
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人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0.5%甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32%,酶比活可达247、7u/mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。 相似文献
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人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD600 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD600为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD600 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。 相似文献
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人三叶因子3在毕氏酵母中的表达及生物活性分析 总被引:4,自引:1,他引:4
利用PCR方法在人胎儿胎盘cDNA中扩增了人三叶因子3基因(hTFF3),插入到含有AOX1启动子和α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,采用毕氏酵母表达系统对其进行了高效的分泌表达,并用G418筛选高拷贝整合转化子。2%甲醇诱导酵母表达48h后,上清经SDS-PAGE和Western印迹证明重组蛋白质以双体的形式分泌表达,占总蛋白质的45%,能被抗hTFF3抗体所识别。表达产物经S-Sepharose、Q-Sepharose离子交换及Sephacryl S-100纯化后纯度达到95%以上。体内生物学活性研究证实hTFF3可有效的防止盐酸诱导的大鼠胃溃疡。 相似文献