钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

钝齿棒杆菌GlnK在氮代谢调控及L-精氨酸合成中的功能

【目的】钝齿棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对氮代谢PⅡ信号转导蛋白GlnK展开相关功能研究,分析其在钝齿棒杆菌氮代谢调控及L-精氨酸合成中的作用。【方法】以GlnK蛋白为研究对象,通过基因敲除等遗传方法获得过表达、敲除及敲弱glnK的重组钝齿棒杆菌,研究GlnK对NH_4~+吸收的影响,通过RT-qPCR和酶活测定,从转录水平和蛋白水平上揭示GlnK对氮代谢和L-精氨酸合成相关基因表达水平及酶活的影响,通过5-L发酵罐发酵产L-精氨酸研究GlnK对L-精氨酸合成的影响。【结果】过表达glnK能明显促进NH_4~+的吸收,而敲除glnK后则会抑制NH_4~+的摄取;RT-qPCR和酶活测定发现,相比于野生型菌株Cc5-5,glnK过表达菌株Cc-glnK中与铵吸收相关的基因,表达量平均上调约4.58倍,L-精氨酸合成基因簇中基因的表达水平平均上调1.50倍。Cc-glnK中氮代谢相关蛋白的酶活平均提高46.97%;L-精氨酸合成途径上7个关键酶的酶活平均提高30.00%;5-L发酵罐发酵各重组菌株结果表明,Cc-glnK菌株的产量可达49.53 g/L,产率为0.516 g/(L·h),相比于出发菌株Cc5-5,其L-精氨酸产量提高了28.65%。【结论】过表达GlnK能促进NH_4~+的吸收及利用,并通过影响L-精氨酸合成途径上关键基因的表达水平,提高关键酶的酶活,最终提高L-精氨酸的产量。本研究为后续探索钝齿棒杆菌氮代谢调控机制及代谢工程改造钝齿棒杆菌生产L-精氨酸提供了一种新的策略。     

钝齿棒杆菌argR基因克隆、表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS.M7是筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。ArgR是精氨酸合成过程中的一种调控蛋白。为进一步验证其在钝齿棒杆菌中对精氨酸合成量的影响,利用特异性引物,分别扩增标准菌C. creantum AS 1.542和诱变菌C. creantum AS.M7的argR全长基因,测序后比较二者的差异;结果表明标准菌argR基因ORF全长516 bp,编码一个含172个氨基酸残基的蛋白;而诱变菌argR基因的109位碱基由C替换为T,导致ArgR蛋白在钝齿诱变菌中表达被提前终止。同时,将来源于标准菌的argR基因连接到穿梭表达载体pXMJ19中,电击转化至诱变菌C. crenatum AS.M7 得到重组菌株,用摇瓶发酵的方法观测重组菌产精氨酸量的变化。SDS-PAGE和Western blot分析证明标准菌的argR基因在诱变菌中得到了表达。对重组诱变菌产精氨酸量进行了测定,结果显示:产精氨酸能力由原来7.8 mg/ml下降至2.5 mg/ml,下降了约67.9%。     

卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能

【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。     

γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193 生理代谢的影响

摘要:【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶( EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase) 基因proB 敲除的菌株,并研究proB 基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR 技术分别扩增proB 基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB 基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C．crenatum 8-193 的pro     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

卡西霉素生物合成调控基因calR2的功能

【背景】卡西霉素(Calcimycin)是由教酒链霉菌NRRL3882产生的吡咯聚醚类抗生素,结构独特且具有广泛的生物活性,但其生物合成调控机制尚不清楚。【目的】研究卡西霉素生物合成基因簇上编码LuxR家族同源蛋白的潜在调控基因calR2的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法对卡西霉素基因簇上的calR2基因进行中断,HPLC对突变株及回补菌株的代谢产物进行分析。利用荧光定量RT-PCR分析ΔcalR2突变菌株和野生菌株的基因转录水平差异。【结果】calR2基因中断的突变株不能产生卡西霉素,回补菌株则恢复产生卡西霉素的能力。RT-PCR结果表明卡西霉素生物合成的一些重要骨架基因在ΔcalR2突变株中的转录水平明显降低。【结论】LuxR家族转录调控基因calR2在卡西霉素生物合成过程中起正调控作用。     

假单胞菌H78中全局调控蛋白Crc对Plt生物合成及其基因表达的调控

【目的】研究Pseudomonas protegens H78中全局调控蛋白Crc对藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt)生物合成及其基因表达的调控。【方法】通过同源重组方法无痕敲除crc基因,并将H78Δcrc突变株与H78野生株在KMB培养基中发酵测定Plt产量;采用lac Z报告分析研究Crc对plt合成基因表达的调控。【结果】突变株H78Δcrc的Plt产量显著下降;Crc在整体水平、转录水平及转录后水平均正调控plt合成基因的表达。【结论】全局调控因子Crc对Plt合成及基因表达表现为正调控作用。     

crgA调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素

【目的】探究crgA基因在三孢布拉霉合成类胡萝卜素过程中的调控作用。【方法】克隆三孢布拉霉crgA基因并利用split-marker策略敲除该基因;在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析。【结果】与野生型菌株相比,crgA基因敲除菌产孢能力明显下降,而类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因转录水平明显提高,在发酵120h后β-胡萝卜素的积累量提高了31.2%。将crgA基因重新导入到敲除菌后,该菌的性状恢复至野生型。【结论】crgA基因调控三孢布拉霉的生长和产孢能力,并通过调控类胡萝卜素关键酶基因表达来调控类胡萝卜素的合成,是一个负调控因子。     

黄脂菌素生物合成基因簇中调控基因xanR3的功能

【目的】研究黄脂菌素产生菌灰黄链霉菌中编码ArsR家族转录调控蛋白(Arsenical resistance regulator)的xanR3基因的功能。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌双亲本接合转移的方法,构建xanR3基因缺失突变株及回补突变株。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR确定黄脂菌素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株中黄脂菌素生物合成基因簇转录水平的检测。【结果】对得到的xanR3基因缺失突变株及回补突变株进行发酵,发现xanR3基因缺失突变株产黄脂菌素能力下降,回补菌株中黄脂菌素产量相比缺失突变株有一定程度的恢复,但仍未达到野生型水平。经鉴定,黄脂菌素生物合成基因簇中共有18个共转录单元,其中4个共转录单元在?xanR3突变株中转录水平明显下降。【结论】ArsR家族转录调控基因xanR3是黄脂菌素生物合成的正调控基因。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism