聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF150%以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐(mPEG-Mal)修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体(PEG-rmhG-CSF)。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95%,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF,NeulastaR○),药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。     

聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF 150％以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐（mPEG-Mal）修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体（PEG-rmhG-CSF）。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95％,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF,Neulasta^?）,药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。     

聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子的研究

制备单修饰的PEG蛋白偶联物,对获得重复性好的修饰产品,减少后续分离步骤具有重要的意义。用N-羟基琥珀酰亚胺活化法对单甲氧基聚乙二醇 (mPEG,分子量20000) 进行活化,红外光谱分析, 并考察了其水解动力学性质。对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行化学修饰,通过正交试验结合SDS-PAGE电泳检测建立了单条PEG链修饰rhG-CSF的条件,单修饰PEG-rhG-CSF的收率为90%。离子交换层析对修饰产物进行分离纯化,高效凝胶过滤色谱(SEC-HPLC)检测纯度达到97%。     

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化

重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）在工程菌ｐＣＧ－１／ｒｈＧ－ＣＳＦ／ＤＨ５ａ中以无活性的包涵体形式大量表达。经过菌体破碎分离包涵体、包涵体变性复性后,ｒｈＧ－ＣＳＦ的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了ｒｈＧ－ＣＳＦ,比活性达１．５７×１０８ｕ／ｍｇ,纯度大于９８％。     

大肠杆菌表达的重组人GM-CSF的纯化

本文对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行纯化,并对纯化的人GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠肝菌中以不溶性包涵体形式存在,经超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10~7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端16个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。     

重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化

利用基因重组技术 ,构建成人肝刺激因子 (hHSS)和谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,以His·Tag亲和层析纯化表达产物 ,FactorXa切割分离hHSS单体 ,并检测其生物学活性。结果显示 ,在pET 4 2a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在 ,GST hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的3 0 % ;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱 ,得到 3 3和 15kD两条蛋白带 ,经Western杂交证实 3 3kD条带为GST ,而 15kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体 ,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—csF)高效表达克隆pzw．GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的人GM—CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM—CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10⁷／mg蛋白质。通过测定纯化人GM—csF的N端l 6个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氮基酸序列完全一致,为大批量重组人GM—CSF的生产创造了条件。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

两步连续离子交换制备色谱分离纯化聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子

建立了两步连续离子交换制备色谱分离、纯化聚乙二醇与重组人粒细胞集落刺激因子 (Recombinanthumangranulocytestimulatingfactor,rhG_CSF)偶联物的方法。首先用阳离子交换色谱将偶联蛋白质和非偶联蛋白质分开 ,然后使用阴离子交换色谱去除过量的游离聚乙二醇杂质 ,并分离纯化偶联蛋白异构体分别得到单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG-CSF。它们经十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析均为单带。采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析三种偶联蛋白质的分子量 ,分别为 23.8kD、28.6kD、33.8kD。用噻唑蓝 (MTT)比色法 ,以粒细胞集落刺激因子的依赖细胞株NFS_6 0为靶细胞 ,测定重组人粒细胞集落刺激因子及其与聚乙二醇的偶联物的体外细胞生物学活性 ,单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG_CSF体外活性保留率分别为 92 %、75 %、4 3%。