《癌细胞》：肝炎与肝癌发生分子机制研究获进展

近日来自美国加州大学圣地亚哥分校、美国桑福德一伯纳姆医学研究所（sanford—Burnham Medical Research Institute）、中国第二军医大学以及意大利都灵大学的研究人员组成的一个研究小组证实Ptpn11／Shp2在肝细胞中发挥重要肿瘤抑制效应。     

Shp2, a novel oncogenic tyrosine phosphatase and potential therapeutic target for human leukemia

Shp2, encoded by the PTPNll gene in human, is a ubiquitously expressed protein tyrosine phosphatase that contains two N-terminal Src homology 2 （SH2） domains （N-SH2, C-SH2, respectively）, a catalytic protein-tyrosine phosphatase （PTP） domain, and a C-terminal tail with tyrosyl phosphorylation sites and a prolyl-rich motif [1]. The progress of our understanding of biological functions of Shp2 has clearly shown that Shp2 plays an important role not only in biology of normal hematopoietic cells and other mammalian cells, but also in the development of leukemia and other tumors. Most recently, PTPNll gene has been firmly established as the first proto-oncogene that encodes a protein tyrosine phosphatase [1-3]. In the hematopoietic system, most if not all function of Shp2 is to act as a positive component that is essential for proliferation and/or survival of hematopoietic cells through regulation of signaling pathways involving Erk, Akt and STATS [ 1-4]. Over the past few years, a number of disease-associated Shp2 mutants have been identified in human leukemia and other malignancies [1, 3, 4]. Recently, studies from our laboratories and others strongly suggest that dysregulation of wild-type Shp2 enzyme may be involved in the pathogenesis of adult leukemia [4-7]. These findings not only provide new insights into the role of Shp2 in leukemogenesis and other tumors, but also suggest new therapeutic targets for anti-leukemia drugs.     

RICH2在肝细胞肝癌中蛋白表达的研究

目的:分析肝细胞肝癌与正常肝组织中RICH2蛋白表达之间的关系,探讨RICH2在肝细胞肝癌发生发展中的作用机理。方法:选取19例肝细胞肝癌患者作为研究对象,用免疫组织化学方法检测肝癌组织和癌旁正常组织中RICH2的表达情况并采用Friedrich免疫反应评分法作为判定标准。采用非参数Wilcoxon秩和检验对RICH2在肝细胞肝癌和正常组织中的评分结果进行统计学分析。结果:19例HCC病例癌旁正常组织中RICH2表达阳性率为100%(19/19),其中RICH2表达强阳性(+++)5例(26.3%),RICH2表达弱阳性(+)和中阳性(++)分别为3例(15.8%)和11例(57.9%);而HCC组织除了两例肝硬化组织未取到癌组织外,17例病例中RICH2表达阳性率仅为11.8%(2/17),表达为+和++各占50%。肝癌组织中RICH2的表达水平显著低于癌旁组织。结论:RICH2有可能通过某种或者其中几种因素作用失活,作用于信号通路,进而促进肝细胞肝癌的发生发展。研究其作用机理,可为临床诊断、治疗及预后评估提供理论依据。     

基因修饰的肝细胞脾内移植后体内分布和基因表达的实验研究

为探讨基因修饰的肝细胞经脾内移植途径介导肝脏基因治疗的可行性和有效性,体外用NeoR基因或IL-2基因修饰小鼠正常胚胎肝细胞BNL CL.2,经脾内移植至正常同系小鼠体内(2×10⁶/只),观察NeoR和IL-2基因在不同脏器的表达.结果发现脾内移植NeoR基因修饰的肝细胞后24h,即可通过RT-PCR在肝脏中检测出NeoR基因mRNA的表达,持续表达11周以上;此外,NeoR基因在脾脏中短暂表达(24h至1周),在肺组织中也有一过性表达(48～96h).脾内移植IL-2基因修饰的肝细胞后,肝脏中可检测到稳定表达的IL-2mRNA(24h至11周),外周血中维持一定水平(5～40pg/mL)的IL-2,能增强肝脏Kupffer细胞Ia抗原的表达及脾细胞的NK杀伤活性.提示基因修饰的肝细胞脾内移植后能定向分布至肝脏,并同化入肝组织中长期存活,有效地表达外源基因,可成为肝脏靶向性基因治疗的可行途径.     

镉诱发肝细胞毒性和胞内Ca2+变化及硒的保护作用研究

本文通过研究镉诱发鼠肝细胞毒性和胞内游离Ca2 变化及硒的干预效应,探讨镉致肝细胞损伤机制及硒的保护作用。分离培养新生鼠原代肝细胞,随机分为正常对照组、4个5、25、100和250μmol/LCdCl2组、2个10和20μmol/LNa2SeO3组和8个用10和20μmol/LNa2SeO3分别与5、25、100和250μmol/LCdCl2联合作用组。在实验后第12h检测肝细胞存活及其MDA含量和培养液中LDH活性,激光共聚焦显微镜分析肝细胞内游离Ca2 水平([Ca2 ]i)。结果显示,镉处理的肝细胞存活随镉浓度增加明显下降,硒处理组与对照组差异不明显;硒提高或明显提高镉染毒肝细胞存活。肝细胞培养上清液LDH活性随镉浓度增加而逐渐升高,且100和250μmol/LCdCl2组显著高于对照组,而硒处理组未见明显变化;给予硒的25、100和250μmol/LCdCl2处理组LDH活性下降或明显下降。不同浓度镉均诱发肝细胞MDA含量显著升高,而硒处理组未见类似表现;10和20μmol/LNa2SeO3抑制或显著地降低25、100和250μmol/LCdCl2诱发的MDA的生成。经镉处理的肝细胞[Ca2 ]i荧光强度明显高于对照组,且随镉浓度的增加而上升,而给予硒的肝细胞[Ca2 ]i荧光强度未见升高,与对照组相近;加入硒的镉染毒肝细胞[Ca2 ]i均比各对应浓度的镉处理组有较大幅度地下降,其中给予硒的25μmol/LCdCl2处理组差异显著,且接近对照组的水平。结果提示,镉诱发肝细胞毒性和损伤以及肝细胞[Ca2 ]i升高;硒可能通过干预肝损伤细胞脂质过氧化反应,改善和保护肝细胞[Ca2 ]i稳态而减轻镉诱发的细胞毒性和损伤过程。     

无血清培养高密度乳猪肝细胞的形态和功能变化

本文研究了无血清培养高密度猪肝细胞的形态和功能变化。将分离的肝细胞以高密度(1×10~7/ml)培养在含激素、多种生长因子和营养成分的无血清培养基中,动态观察培养7天中肝细胞形态、活率、蛋白质合成功能、G-6-Pase活性、安定转化功能及LDH含量;同时以无血清培养低密度(5×10~5/ml)肝细胞作为对照组。研究结果表明:高密度培养的 肝细胞各项功能较低密度培养的肝细胞为低;高密度培养的肝细胞的形态、蛋白质合成功能在培养7天中保持稳定;活率随着培养时间的延长而下降,但均高于90％;安定转化功能在培养第2、3天最强;G-6-Pase活性在培养1天后明显下降,然后维持在较低水平;LDH含量在第1、2、3天较高。     

ES细胞体外定向分化为成熟肝细胞的实验研究

探讨了肝细胞在胚胎干细胞（ES cell）体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法.利用TGF, bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导.利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学（ICC）和放射免疫法（RIA）动态检测肝细胞特异性基因和蛋白AFP,ALB,G6P,TAT,CK8, CK18等在培养体系中的表达,并测定肝细胞的尿素合成功能,最后测定肝细胞分化率.结果,肝细胞特异基因AFP, ALB,G6P和TAT最早分别于第3、9、11、13天表达,肝细胞特异蛋白AFP,CK8,CK18和ALB最早分别于第7、9、9和11天开始表达.第12天开始检测到尿素出现,浓度为8.3 μmol/L,并随培养时间延长而浓度逐渐增加.最后,测得生长因子诱导组肝细胞的分化率为32％,对照组肝细胞分化率为8%.说明肝细胞可以在ES细胞体外诱导分化系统中出现并成熟分化,bFGF、HGF、OSM等可以明显提高细胞分化率和成熟度,有望成为解决肝功能替代疗法中细胞来源问题的新希望.     

去泛素化酶JOSD2促进肝癌细胞的存活和转移

蛋白质泛素化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰,在信号转导和蛋白质稳定性调控中发挥关键作用。去泛素化酶调控在许多种肿瘤中的作用机制尚不清楚。本文对63种去泛素化酶在肝细胞癌病人的生存和预后进行分析,发现去泛素化酶JOSD2(josephin domain containing 2)在肝细胞癌组织中表达显著高于癌旁(P<0.0001),且与总生存期相关(P<0.05)。JOSD2属于去泛素化酶MJD(machado josephin domain)亚家族成员,该家族其它成员与肝细胞癌发生无显著的相关性。对TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据中JOSD2高表达样本和低表达样本的差异基因进行功能富集分析,显示JOSD2高表达样本中与细胞增殖相关通路显著富集(FDR<0.05)。在肝癌细胞系中过表达JOSD2,发现其能促进肝癌细胞的存活、迁移和侵袭(P<0.01)。综上所述,本文发现去泛素化酶JOSD2在肝细胞癌组织中高表达,高表达JOSD2的肝细胞癌病人总生存期显著降低(P=0.041),过表达JOSD2能促进肝癌细胞的存活和转移,提示JOSD2可能促进肝细胞癌的转移。     

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

为了利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系,分离获得胚胎12~14d胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系.胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长.分离培养获得的肝干/祖细胞,克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加.定量PCR结果显示,随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、Ep CAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平.本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞的肝细胞功能进一步成熟.     

草鱼肝细胞的分离与原代培养

目的以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞为实验对象,在不同条件下进行原代培养,以探讨适合草鱼肝细胞生长的最佳条件及培养方法,用于饲料营养与非营养物质对草鱼肝细胞代谢、损伤作用机制的研究。方法采用温胰蛋白酶消化法和红细胞裂解液分离、纯化肝细胞,MTT法测定细胞增殖率,并测定不同时期培养液上清液中LDH、Alb和BUN的含量,分析肝细胞生长状况。结果采用0.25%浓度的温胰蛋白酶消化法,消化20min,分步收集肝细胞,经台盼蓝染色检测和血球计数板计数,活细胞数≥99%。结论在含10%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199培养基中,以接种浓度1.7×106cell/mL左右为宜,置于27℃、4.5%CO2浓度的恒温培养箱中,可成功培养草鱼原代肝细胞。     

大鼠再生肝8种细胞的丝氨酸族氨基酸代谢相关基因的转录谱

为了解大鼠肝再生中8种肝脏细胞的丝氨酸族氨基酸代谢相关基因转录谱, 文章用Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选分离大鼠的8种再生肝细胞, 用Rat Genome 230 2.0芯片等检测它们中丝氨酸族氨基酸代谢相关基因的表达变化, 用Cluster和Treeview等软件分析上述基因在肝再生中表达模式, 用生物信息学和系统生物学等方法分析上述细胞中丝氨酸族氨基酸代谢活动。结果表明, 在27个发生有意义表达变化的基因中, 肝细胞、胆管上皮细胞、卵圆细胞、肝星形细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、陷窝细胞、树突状细胞的基因数分别为13、16、11、14、13、11、12、14, 相应细胞的上调、下调和上/下调的基因数分别为7、6和0, 2、10和4, 2、8和1, 8、3和3, 6、5和2, 4、6和1, 2、10和0, 6、6和2。总的来看, 肝再生中各细胞的表达下调基因占优势, 但在肝再生启动阶段, 肝星形细胞和窦内皮细胞的表达上调基因占优势。上述丝氨酸族氨基酸代谢相关基因转录谱预示丝氨酸族氨基酸的合成主要在肝再生启动阶段的肝细胞、肝星形细胞、窦内皮细胞和库普弗细胞中增强, 它们的降解主要在肝再生进展阶段的肝细胞、胆管上皮细胞、陷窝细胞和树突状细胞中进行。     

RNAi干扰Shp2基因对K562细胞增殖的抑制效应

通过RNA干扰技术沉默蛋白酪氨酸磷酸酶跏2基因,构建重纽质粒,采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）法、Westernblot、MTT法、流式细胞术（FCM）分别检测转染后K562细胞中bcr／abl融合基因、bcr／abl融合蛋白的表达水平、细胞生长增殖变化及细胞凋亡率,探索该基因的沉默表达对K562N胞的抑制作用。结果表明,该实验成功构建出能明显下调Shp2基因及其蛋白表达的重组质粒,转染K562细胞后,其bcr／abl融合基因及融合蛋白水平均明显降低、K562细胞增殖活力被抑制（P〈0．05）、细胞凋亡水平上升（P〈0．05）。与对照组相比,其差异具有统计学意义。提示,重组质粒可显著降低bcr／abl基因及蛋白的表达,抑制K562细胞的生物学效应,表明在细胞水平沉默Shp2有可能成为治疗慢性粒细胞白血病的有效靶点。     

Salubrinal对铜负荷诱导的PERK/eIF2α内质网应激信号通路介导肝细胞凋亡的干预作用

Wilson病是一种以肝损害为常见临床表现的常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病,但铜蓄积导致的肝细胞损害的具体分子机制尚不明确。本研究拟采用硫酸铜模拟肝细胞铜负荷进行体外实验,选用Western印迹法测试铜负荷肝细胞内蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)及p-eIF2α蛋白质的表达;并探究特异性eIF2α磷酸化抑制剂Salubrinal对铜负荷诱导的肝细胞凋亡、胱天蛋白酶-3活性、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）mRNA转录的影响。选用流式细胞仪测试肝细胞凋亡率;比色法测试肝细胞内的胱天蛋白酶-3活性;Real-time PCR法检测肝细胞内CHOP mRNA转录水平。本研究结果显示: (1) 铜负荷显示出时间依赖性地增加肝细胞内PERK及p-eIF2α蛋白质表达(P<0.05, P<0.01)。(2)相比较对照组,铜负荷培养肝细胞24 h明显增加了肝细胞的凋亡率(P<0.01),增强了肝细胞内的胱天蛋白酶-3活性,促进肝细胞内CHOP mRNA的转录,加入特异性eIF2α磷酸化抑制剂Salubrinal后可抑制上述过程。(3)相比较对照组,铜负荷促进肝细胞PERK及p-eIF2α蛋白质表达,加入特异性eIF2α磷酸化抑制剂Salubrinal后,对铜负荷诱导的肝细胞PERK蛋白质表达无影响(P>0.05),但可显著抑制铜负荷诱导的肝细胞p-eIF2α蛋白质表达(P<0.01)。本研究结果提示,铜负荷可以诱发肝细胞内质网应激,铜负荷引起的肝细胞凋亡机制与激活内质网应激PERK/eIF2α信号通路密切相关, Salubrinal具有干预该信号通路作用,能够抑制铜负荷后肝细胞的凋亡。     

L-茶氨酸对H_2O_2致L02细胞损伤的保护作用及其机制研究

研究L-茶氨酸对肝细胞损伤的保护作用及其机制。利用H2O2诱导的L02肝细胞损伤模型,分别用MTT法检测细胞存活率、测定LDH、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白表达及Bax/Bcl-2比值的变化,评价L-茶氨酸是否能保护H2O2诱导的肝细胞损伤。结果表明,L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02细胞存活率,减少LDH的渗漏,降低肝细胞凋亡,且L-茶氨酸通过抑制Caspase-3的激活和PARP的切割及Bax/Bcl-2比值的升高而发挥抗凋亡的作用。L-茶氨酸对肝细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

银杏内酯B抑制缺氧诱导的肝细胞凋亡

目的研究银杏内酯B对缺氧诱导肝细胞凋亡的影响。方法将原代培养的新生鼠肝细胞随机分为5组:正常对照组(N组)、缺氧对照组(H组)、缺氧加银杏内酯B(B1组、B2组、B3组)终浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml,缺氧(95%N2+5%CO2)12h建立缺氧模型,细胞荧光染色检测和流式细胞仪测定各组肝细胞凋亡率。结果缺氧引起肝细胞凋亡明显,加入银杏内酯B肝细胞凋亡数显著降低,但不同浓度银杏内酯B保护组间无显著性差异。结论银杏内酯B对缺氧导致的肝细胞凋亡有保护作用。     

甘氨酰组氨酰赖氨酸 (GHK)的液相合成及其酶促降解

甘氨酰组氨酰赖氨酸 (GHK )是 1973年由Pickart等首先从人血浆中分离得到的一种三肽 .最初实验发现 ,GHK能增加大鼠正常肝细胞的存活率及促使肝癌细胞的生长 ,并刺激这些细胞DNA和RNA的合成 ,因此被称为肝细胞生长因子[1,2 ] .GHK和二价铜离子有很强的亲和力 ,能自发地与其形成络合物 (GHK Cu) .最新研究还表明 ,GHK及GHK Cu可促使神经细胞、免疫相关细胞和肾小球细胞的生长、分裂和分化[3 ] .GHK Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成[4] .由于GHK分子中有 2个碱性氨基酸 ,给人工合成带来了许多困难 .我们…     

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

目的 利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系。 方法 分离获得胚胎12-14天胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系。 结果 胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长。分离培养获得的肝干/祖细胞克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加。Q-PCR结果显示随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、EpCAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平。 结论 本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞肝细胞功能进一步成熟。     

葡萄糖对鹅原代肝细胞脂质沉积相关基因及酶活性的影响

通过用葡萄糖培养天府肉鹅(Anser cygnoides)原代肝细胞的试验,探讨葡萄糖对肝细胞脂质合成能力的影响.研究发现:0²5 mmol/L葡萄糖对肝细胞上清液中谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine amiotransferase,ALT)浓度没有显著影响,35 mmol/L葡萄糖影响显著,但AST、ALT浓度均在正常范围内,表明肝细胞功能正常;油红氧染色实验结果表明:葡萄糖处理后显著增加细胞内脂滴集聚和脂质沉积;25、35 mmol/L葡萄糖能显著增加乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylaseα,ACCα)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)酶活性;5、25、35 mmol/L葡萄糖都能显著增加ACCα、FAS基因mRNA表达量.因此,葡萄糖能通过上调ACCα、FAS基因mRNA表达量及酶活性诱导肝细胞内脂质沉积.     

荧光定量PCR观察鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的动态变化

通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)观察后天感染和先天感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化,探讨适宜于抗HBV药物的体外实验、HBV生物学特性及乙型肝炎发病机制研究的鸭胚肝细胞模型.筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚并进行肝细胞原代培养,对DHBV阴性鸭胚肝细胞原代培养,并以不同浓度的DHBV强阳性血清感染细胞.于细胞接种后不同时间点收集培养上清,FQ-PCR检测分析培养上清DHBV DNA的含量.结果显示:先天感染的鸭胚肝细胞接种第2 d上清中DHBV载量最高,第3 d大幅下降,然后缓慢上升,第8 d达到高峰,至第15 d时仍然与高峰时接近,DHBV载量的数量级都在10<'8>copies/mL没有变化;后天感染不同浓度的DHBV阳性血清的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量动态变化趋势基本一致,DHBV感染后第3 d大幅下降,以后逐渐上升,至第11 d达高峰,第15 d又略有下降.结论:先天感染DHBV的鸭胚肝细胞的培养上清病毒载量上升至峰值时间短,病毒载量稳定,更适合于抗HBV药物的体外实验研究.