两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)是一种突触后神经毒素,广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中,对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列,并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照,从同一次反转录得到的cDNA混合物中,克隆了蛇毒神经生长因子cDNA,并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况,发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化,因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来,同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况,因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

α-银环蛇毒素基因的克隆与表达

与传统的捕蛇或养蛇提毒的方法相比,利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显的潜在优势。本研究结合国内外的研究现状,以α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)为例子来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其DNA序列并设计成部分互补的4条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化其寡核苷酸片段,通过片段退火、切口补平、连接、克隆、测序鉴定获得了α-银环蛇毒素基因;然后将α-银环蛇毒素基因克隆至pGEX-2T质粒中分别转化大肠杆菌DH5(和JM109进行表达分析,融合蛋白约占细菌总蛋白的30％～40％,其中部分为可溶性表达,部分以包含体的形式表达;对可溶性表达的条件进行了优化。最后以天然纯化的α-银环蛇毒素作为对照,分析融合方式表达的重组α-银环蛇毒素的活性,ELISA结果显示其与天然的α-银环蛇毒素比较具有相似的抗原性。     

α—银环蛇毒素基因的合成与表达

结合国内外的研究现状,以α－银环蛇毒素为例来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α－银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其ＤＮＡ序列并设计成部分互补的４条寡核苷酸片段,利用ＤＮＡ合成仪人工合成,纯化这４条寡核苷酸片段,通过片段退火,切口补平,连接,克隆,测序鉴定获得了α－银环蛇毒素基因,然后将ａ－银环蛇毒素基因克隆至ｐＧＥＸ－２Ｔ质粒中分别转化ＤＨ５α和     

银环蛇神经毒素的分子克隆和功能表达(英文)

抽提银环蛇毒腺总ＲＮＡ,通过反转录ＰＣＲ技术扩增出其神经毒素ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。银环蛇神经毒素的ｃＤＮＡ编码２１个氨基酸的信号肽和７４个氨基酸的成熟蛋白。该信号肽非常类似于短链神经毒素、κ－神经毒素和心脏毒素的信号肽。而成熟蛋白的氨基酸序列与从台湾产银环蛇中通过蛋白测序鉴定的α－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ的氨基酸序列完全一样。此外,还克隆到该神经毒素缺失前体ｃＤＮＡ。利用麦芽糖结合蛋白融合     

绿豆Ty1/Copia类反转录转座子逆转录酶序列的克隆和分析

利用Ty1/copia类反转录转座子的保守位点设计简并引物,从绿豆(Vigna radiata(L.)Wilczek)基因组中扩增得到了反转录转座子的逆转录酶序列.对扩增得到的约270bp的片段进行分离和克隆,并随机挑选了40个克隆进行测序,结果得到了36个单独的核酸序列,其中18个含有移码突变或终止子.根据序列比对,这些克隆可分为9组以及单个的9种.这40个克隆中,核酸序列相似性从8%到100%,显示出其核酸序列的高度异质性.将这些克隆的核酸序列与来自其他种植物的相应序列进行谱系分析,发现有些克隆与来自其他种植物的相应序列的亲缘关系比这些克隆之间更为接近.斑点杂交显示Ty1/copia反转录转座子约占绿豆基因组的9.3%.     

绿豆Ty1／Copia类反转录转座子逆转录酶序列的克隆和分析

利用Ty1/copia类反转录转座子的保守位点设计简并引物,从绿豆(Vignaradiata(L.)Wilczek)基因组中扩增得到了反转录转座子的逆转录酶序列。对扩增得到的约270bp的片段进行分离和克隆,并随机挑选了40个克隆进行测序,结果得到了36个单独的核酸序列,其中18个含有移码突变或终止子。根据序列比对,这些克隆可分为9组以及单个的9种。这40个克隆中,核酸序列相似性从8%到100%,显示出其核酸序列的高度异质性。将这些克隆的核酸序列与来自其他种植物的相应序列进行谱系分析,发现有些克隆与来自其他种植物的相应序列的亲缘关系比这些克隆之间更为接近。斑点杂交显示Ty1/copia反转录转座子约占绿豆基因组的9.3%。     

猪CFL2b基因部分序列的克隆及组织表达谱分析

在猪QTL定位基础上,利用比较基因组学原理,参照猪CFL2的cDNA序列,对猪CFL2基因的部分基因组DNA序列进行克隆、测序;利用RT-PCR半定量法检测CFL2基因在不同组织的表达情况.结果显示,所克隆的CFL2基因部分基因组DNA序列长度为2 377bp,包括4个外显子和4个内含子,该基因mRNA序列与已报道的人CFL2b基因序列相似性为89%;猪CFL2基因在多种组织中均有表达,但在骨骼肌和心肌中表达丰度较高.结果表明,本研究成功测序了猪CFL2b基因部分基因组DNA序列,为进一步研究该基因与肌肉发育及生理功能的关系奠定了基础.     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6．5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT—PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F／HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmBI将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F／HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。     

牛气管黏膜抗菌肽成熟肽基因的克隆及序列分析

目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子进行测序,将测序结果与已报道的序列进行比较,并做NCBIBlast比对。结果:PCR扩增出bTAP成熟肽基因,核苷酸序列测定验证了其正确性;NCBIBlast比对表明,与bTAP成熟肽基因同源性较高的分别是牛β-防御素11、牛β-防御素12、牛β-防御素402、牛β-防御素403、绵羊β-防御素1、绵羊β-防御素2、山羊β-防御素1及山羊β-防御素2,核苷酸序列同源性分别为78.07%、78.95%、80.70%、83.33%、83.33%、80.70%、81.58%和81.58%,氨基酸序列同源性分别为68.42%、65.79%、68.42%、76.32%、71.05%、63.16%、63.16%和68.42%。结论:成功克隆了bTAP成熟肽的基因序列,NCBIBlas比对表明bTAP与防御素可能来自一个共同的祖系基因。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

瘤胃细菌GH48家族糖苷水解酶基因多样性

【目的】了解瘤胃细菌第48家族糖苷水解酶基因(GH48)多样性,为木质纤维素高效降解提供新的基因资源。【方法】通过基因序列比对,设计gh48的简并引物;同时提取两个瘤胃样品的总DNA和总RNA,并将总RNA逆转录成cDNA。以总DNA和cDNA为模板,通过PCR扩增分别建立克隆文库并对克隆文库进行测序;对所得序列进行out种类划分和聚类分析。【结果】本研究共得到了455条编码GH48家族蛋白的基因序列,核苷酸序列之间的相似性为58.65%-100%。对序列的进一步分析表明,89%可以作为区分其种类的界定标准。以此为依据确定所得到的基因序列分别编码66种不同的GH48家族蛋白,分别聚为5个相对独立的类群,其中新类群C中OTU65所代表的序列是cDNA克隆文库中的优势序列,分别占两个cDNA克隆文库的36.4%和19.5%。我们的结果揭示瘤胃细菌gh48基因具有丰富的多样性,同时,其中也存在优势表达的GH48家族蛋白。     

人TRAIL基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人TRAIL的基因组结构,生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增出人TRAIL基因编码区cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体中,序列测定表明,克隆片段与文献报道的人TRAIL基因编码区cDNA序列完全一致.     

人凝血因子Ⅶ cDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰*

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6.5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT-PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F/HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmB I将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基     

重组α-银环蛇毒素P22-A31的原核表达及功能分析

α-银环蛇毒素在神经科学研究以及在临床和制药上有重要作用,为获得大量的α-银环蛇毒素,我们用已构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用谷胱甘肽Sepharose FF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白,再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST),得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素,得率约为1.225mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体,经ELISA和Western杂交鉴定后可知重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。小鼠毒性试验表明,重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg,约为天然α-银环蛇毒素的1/5。小鼠化学法镇痛试验显示,重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效,1/4LD50剂量的镇痛百分率为55.2%,1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5%,在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆和全序列测定

以加工番茄"87-5”为材料,采用反转录PCR(RT-PCR)技术将加工番茄PG基因的cDNA序列克隆到pGEM-T载体上,并进行了全序列测定分析.结果表明,加工番茄的PG基因的cDNA与国内外报道的番茄PG基因的cDNA,在碱基序列及氨基酸序列上均有差异.说明番茄的PG基因具有多态性.