一种高效克隆PCR产物的方法

利用TaqDNA聚合酶3′末端非模板依赖性加碱基的特性,制备了3′末端带T载体,与18种PCR产物进行连接反应。结果,阳性克隆率达40％—70％,而对照组小于10％。证明该方法是一种高效节省适用范围广的好方法。     

PCR产物克隆方法的新进展

ＰＣＲ产物克隆方法的新进展陈尚武,马涧泉（中山医科大学生化教研室．广州）随着ＰＣＲ技术的发展和普及,克隆ＰＣＲ产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。通常ＰＣＲ产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性...     

可直接克隆PCR产物的克隆载体的构建

本文描述一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒氨苄抗性基因的Eam1105 I 酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam1105 I 酶切位点。经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞仍具有氨苄抗性。将一人工合成的具有两个Eam1105 I 酶切位点的互补寡聚核苷酸链（两端具有BamH I 接头）插入已封闭Eam1105 I 酶切位点的pUC118*载体的BamH I 位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam1105 I 酶切后,可产生3′末端突出一个T碱基的T-载体,能与PCR产物直接连接。 Abstract:A new method for construction of a cloning vector (T-vector) for direct ligation with PCR products was described.The T-vector derived from pUC118 in which the unique restriction site of Eam1105 I in the region of Ampr gene was deleted and an artificial DNA fragment flanking two Eam1105 I was introduced at the site of BamHI.The modified vector was named as pUC118E.A T-vector with 3′over hang end of a single T can be obtained via digesting of pUC118E with Eam1105I.PCR products can be easily cloned with this T-vector.     

影响RT—PCR产物克隆的因素及其方法的优化

在对１２个以ＲＴ－ＰＣＲ扩增后的ｃＤＮＡ片段进行克隆的工作中,讨论了影响克隆效率的几个因素,并对原有的部分克隆步骤作了优化,取得了对适当长度基因片段进行克隆的快速、简便的方法。     

PCR筛选阳性克隆方法的改进

ＰＣＲ筛选阳性克隆具有简便、快速的优点,但常发生假阳性错误。用与载体匹配的引物和目的的基因引物组合进行ＰＣＲ,可以消除假阳性,同时可以判断插入目的基因的方向。     

提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如,引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆,以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。     

一种克隆PCR产物的新方法

一种克隆ＰＣＲ产物的新方法周复春,李学伍,吴斌,陈焕春（华中农业大学牧医系,武昌）基因克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究必不可少的组成部分。ＰＣＲ基因扩增可以产生微克级的特异性刀ＮＡ片段,可以简化从基因组ＤＮＡ克隆单拷贝基因片段的步骤。到达这种数...     

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。     

PCR产物直接测序还是克隆测序 密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属（Athrotaxis）植物rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列进行了测定与分析。实验表明A. selaginoides rDNA重复序列间的纯合程度很高, 对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A. laxifolia、A. cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低,各重复单位间序列存在插入/缺失,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A. laxifolia、A. cupressoides的ITS2区尽管也存在 多态性,但不同重复序列的浓度比较平均,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同,同一植物ITS的不同区域,其重复序列间的纯合程度也不同,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

一种自制T-载体的构建

TaqDNA聚合酶由于其具有非模板依赖型末端转移酶活性常使PCR产物的 3′末端形成一个dA突出。实验通过在pGEM 7Zf ( + )质粒的多克隆位点中插入少数新的酶识别位点 ,使其改造成为能被XcmI限制内切酶消化后可形成 3′末端具有一个dT突出的pGEMXT 载体 ,从而易于与具有 3′dA的PCR产物直接连接 ,并通过蓝白斑筛选而获得重组克隆。这种新构建的载体由于新添了相应的酶切位点还可用BamHI或HindIII单酶切出其中所插入的片断 ,方便了后续分析工作的进行。     

一种简单、快速、有效的PCR产物克隆方法

一种简单、快速、有效的ＰＣＲ产物克隆方法李红卫,涂长春,金扩世,章金刚（长春农牧大学兽医研究所,长春１３００６２）关键词ＰＣＲ,克隆我们实验室在用ＰＣＲ法扩增和克隆病毒ｃＤＮＡ片段过程中,摸索了一种既不需设计酶切位点,也不需要纯化ＰＣＲ产物及特殊载体...     

PCR产物直接测序还是克隆测序?——密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属 (Athrotaxis)植物rDNA内转录间隔区 (ITS)及5 .8SrDNA序列进行了测定与分析。实验表明A .selaginoidesrDNA重复序列间的纯合程度很高 ,对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A .laxifolia、A .cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低 ,各重复单位间序列存在插入 /缺失 ,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A .laxi folia、A .cupressoides的ITS2区尽管也存在多态性 ,但不同重复序列的浓度比较平均 ,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物 ,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同 ,同一植物ITS的不同区域 ,其重复序列间的纯合程度也不同 ,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

用两步PCR法克隆全长cDNA

采用两步 PCR法成功地克隆了一个全长的 c DNA.首先 ,用差式分析法克隆得到差别表达的 c DNA片段 ,再分别用这些片段内部的特异序列及 c DNA两端不同接头的序列为引物进行第一步 PCR扩增 ,得到差别 c DNA片段的上游和下游序列 .然后 ,根据第一步 PCR扩增得到的上游和下游序列设计基因特异的引物进行第二步 PCR,从而得到全长的 c DNA.     

提高PCR产物克隆效率的几种途径

从提高PCR产物纯度,增加产物特异性入手,较详细地分析了影响PCR产物克隆效率的四个主要因素,并就每种影响因素给出了较为详尽的提高克隆效率的途径．     

PCR产物直接分子克隆的比较研究

本文比较了ＰＣＲ产物的三种分子克隆技术,实验证明其中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶切平和Ｔ－Ａ互补法较凝胶电泳回收加Ｋｌｅｎｏｗ酶切平法远为有效和简便。对这几种克隆技术的方法学还作了进一步的讨论。     

质粒克隆载体研究进展

质粒克隆载体研究进展靳卫东宋增璇（中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津３０００２０）关键词质粒克隆载体质粒是基因工程重要的载体之一。它是细胞内的共生型遗传因子,它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些特殊表型。质...     

PCR克隆新基因策略研究进展

自从PCR被开发及其基本反应条件被优化以来,这项技术已被应用于分子生物学研究的各个方面。其中应用最多的是从给定的有机体中扩增和克隆新基因：那些从事新基因的结构和功能分析研究的工作者必须获得第一手资料,也就是新基因的序列。而且快速方便地克隆这些新基因序列在很大程度上依赖于那些由PCR技术演变而来的方法。本文综述概括了建立在PCR基础上的方法在新基因分离克隆中的各种应用.     

PCR简便快速筛选阳性克隆

目前常用的筛选阳性重组子的方法主要有快提质粒酶切法及杂交筛选法[1] ,但这两种方法均存在不足之处。比如快提质粒法需要提取质粒 ,在筛选大量样品时操作比较繁琐 ;而杂交法存在操作周期长并要使用同位素等不足。由于ＰＣＲ技术具有操作简便且灵敏度极高的特点[2 ] ,近年出现了一些利用ＰＣＲ技术筛选阳性克隆的方法[3] ,但这些方法在制备ＰＣＲ扩增模板时仍然需要提取被筛选样品菌的质粒。我们用溶菌酶处理被筛选样品菌细菌悬液 ,并对悬液加热 ,以使质粒分散于菌细胞之外。然后直接以该悬液为模板 ,使用ＰＣＲ对重组质粒上的特定序列进行…