一种简单高效扩增人杯状病毒ORF2区RT-PCR方法的建立及其意义

人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),是单股正链RNA病毒,长约7·5 kb,其3′末端有poly(A)结构。它可分为两个属:诺如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)[1],根据病毒抗原性和核苷酸序列的多样性,目前将诺如病毒和札如病毒分别划分为三个遗传组(group),每一遗传组依据RNA多聚酶及衣壳蛋白区域序列的差异,可进一步划分为不同群或基因型(cluster or genotype)。病毒基因组包括3个开放读码框(open reading frame,ORF),5′端和3′端各有一个小的非编码区。ORF1编码非结构蛋白的前体聚蛋白,其中包括RNA…     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

3′-poly(A)~-病毒RNA的大分子cDNA的合成和克隆

为了合成3′端无poly(A)的病毒RNA(登革热病毒Ⅱ)的3′区的长的cDNA,我们用RNA连接酶,把3′端被pCp封闭了的poly(A)<50bp连在病毒RNA的3′端,构成一个病毒RNA-poly(A)-pCp型模板,可用oligo(dT_(10-12))作引物,再用Watson和Jackson(1985)的RNase H代替硷降解法来合成cDNA。结果获得了≥5kb的cDNA。重组克隆的鉴定证明这个大分子cDNA确是病毒RNA 3′区的拷贝。这将有利于对这类RNA病毒基因组的结构-功能分析和对病毒cDNA拷贝的感染性的研究。     

牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)属反转录病毒科泡沫病毒属.其基因组两端为长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR),中间部分除gag、pol、env三个结构基因外,还有两个重叠的读码框ORF-1、2,起始于env基因3′端,终止于3′LTR,编码Borf-1、Borf - 2等多种调节蛋白[1～3].     

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。     

牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

牛泡沫病毒 (Ｂｏｖｉｎｅｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ,ＢＦＶ)属反转录病毒科泡沫病毒属。其基因组两端为长末端重复序列 (Ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ,ＬＴＲ) ,中间部分除ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ三个结构基因外 ,还有两个重叠的读码框ＯＲＦ 1、2 ,起始于ｅｎｖ基因 3′端 ,终止于 3′ＬＴＲ ,编码Ｂｏｒｆ 1、Ｂｏｒｆ 2等多种调节蛋白[1～ 3 ] 。其中Ｂｏｒｆ 1为ＢＦＶ的反式激活因子 ,可显著激活ＢＦＶＬＴＲ启动子起始的基因表达。近年来 ,在泡沫病毒家族成员人泡沫病毒 (Ｈｕｍａｎｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ,ＨＦＶ)和猴泡沫病毒(…     

森林脑炎病毒分子生物学研究进展

森林脑炎(TBE)病毒属黄病毒科,基因姐RNA含有单个开放阅读框架,5′端编码病毒的结构蛋白,3′端编码非结构蛋白。翻译成聚蛋白后,通过细胞和病毒编码的蛋白酶裂解产生单个的病毒蛋白。成熟的病毒是由两个相关的E和M膜蛋白脂质包膜所包围的立体对称的核衣壳组成。包膜E蛋白在病毒的感染周期中对细胞的识别和穿入细胞具有极其重要的功能,同时E蛋白诱导保护性的免疫反应,E蛋白内某一位点单个氨基酸的改变可引起病毒毒力的改变。因此,对TBE病毒分子生物学的研究有助于了解病毒与宿主细胞相互作用的机理,为病毒感染的特异性诊断、疫苗的研制和抗病毒药物的设计提供理论依据。     

中国6株狂犬病病毒街毒株全基因组测序与分析

实验研究中对分离于中国的6株狂犬病病毒街毒株进行了全基因组测序,对基因组的5个结构基因(N、P、M、G和L)的核苷酸和推断的氨基酸序列以及非编码区序列进行了分析与比较,并与来自GenBank的40株毒株从全基因组水平进行了分子进化分析。所测6株中国狂犬病病毒街毒株的全基因组核苷酸序列长度介于11 907 nt(CQ92)和11 924 nt(SH06和gg4)之间,基因组结构相同,用全基因组和不同的结构基因构建的进化树拓扑结构相似,基因组3′和5′末端高度保守而且末端11个核苷酸互补配对,5个结构基因的保守性依次是NLMGP,核苷酸同源性的最小值依次分别是81.9%、81.7%、80.7%、78.3%和76.7%。     

反义寡核苷酸体外抗流感病毒活性

为了获得具有抗流感病毒活性的反义寡核苷酸,针对A型流感病毒基因组3′和5′端保守序列,设计并合成了多条硫代寡核苷酸(ODN)：3′端反义ODN(IV3#)与3′端正义ODN(IV3S);5′端反义ODN(IV4#)与5′端正义ODN(IV4S)以及由5′和3′端正义/反义保守序列组成的复合序列ODN(IV6#和IV7#)。测定了PSODN的体外细胞毒性和在MDCK细胞中对流感病毒复制的影响。结果表明：(1)PSODN浓度高达50μmol/L时对MDCK细胞末表现有毒性作用;(2)与流感病毒基因组5′端互补的ODN IV4#以及由5′和3′端保守序列构成的IV6#ODN和IV7#ODN均具有较高的抗病毒活性;如IV4#ODN浓度为1μmol/L时对流感病毒A/京防/861(H1N1)抑制率近50%,浓度为10μmol/L或更高时抑制率超过70%,且IV4#抑制病毒活性呈现明显的序列和剂量依赖性;(3)IV4#ODN不仅对A型流感病毒H1N1亚型有抑制作用,对H3N2亚型也表现较高的抑制活性;(4)病毒感染复数(MOI)对IV4#ODN抗病毒活性有一定影响,当MOI较低时,IV4#ODN表现的剂量效应关系更加明显。抗流感病毒反义寡核苷核IV4#ODN的发现为进一步研究流感新型药物奠定了实验基础。〖HTH〗关键词〖HTSS〗：流感病毒, 反义寡核苷酸, 体外细胞毒性, 抗病毒活性, 感染复数     

登革热病毒基因组末端cDNA的克隆及序列分析

采用磁性分离技术从登革热病毒(D2-04株)感染的C6/36细胞中分离了D2-04病毒RNA.以该RNA为模板进行RT-PCR,分别扩增了D2-04 RNA 5′和3′端cDNA片段,该cDNA片段分别克隆到pGEM-3Z质粒多聚接头的HincⅡ位点得到含有5′端284 bp及3′端525 bp cDNA的重组质粒.通过荧光标记引物及双脱氧核苷酸PCR方法测定了上述cDNA插入片段的序列.同源性比较结果证明D2-04株与其他不同株间的同源性较高,可达93%～98%;不同型间的同源性较差, 仅80%左右; 属间的同源性更低.     

甘蔗杆状病毒及其启动子功能的研究进展

甘蔗杆状病毒(SCBV)是侵染甘蔗的重要病原物之一,属于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)。该病害在多数种植甘蔗的国家和地区普遍发生,可导致甘蔗品质和产量下降,对甘蔗产业构成潜在威胁。SCBV基因组为环状双链DNA,长度为7.3~8.0 kb。不同地理来源的SCBV分离物遗传多样性丰富,全球至少存在18种系统进化组群或基因型(SCBV-A~R),其中,来自摩洛哥的SCBMOV、澳大利亚的SCBIMV及瓜德罗普岛的SCBGAV和SCBGDV被国际病毒分类委员会(ICTV)认定为杆状DNA病毒属下的4个不同病毒种。SCBV基因组编码3个开放阅读框(ORF),其中ORF3的3′端和ORF1的5′端之间基因间隔区域为病毒启动子区域。本文主要综述了SCBV生物学和基因组特性、遗传多样性、检测方法、病毒启动子的功能及应用等方面的最新研究进展,旨在为SCBV的进一步研究提供参考。     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物外壳蛋白基因与3′非编码区的序列分析

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,Tobamovirus属病毒基因组至少编码4个蛋白,靠近5′端的126kDa和183kDa两个蛋白与病毒的复制有关,其中183kDa是由126kDa蛋白终止子超读产生的;另外两个蛋白分别为约30kDa的移动     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

 为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

我国大蒜潜隐病毒的基因组结构及3′端序列的变异

从我国6个省市12个大蒜样品上共检出10个不同的香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)分离物, 测定了浙江分离物ZJ1的基因组全序列和其他9个分离物的基因组3′端序列. ZJ1分离物RNA基因组全长8363个核苷酸, 3′端具polyA尾, 含6个可读 框(ORF), 分别编码复制酶, TGB1, TGB2, TGB3, CP和NABP, 基因组结构和其他Carlavirus属成员相似. 序列分析表明, 10个分离物均为大蒜潜隐病毒(GarLV), 不同分离物TGB2, TGB3和NABP的差异大于CP的差异, 且这些分离物和葱潜隐病毒(ShLV)也具有很高的同源性. 系统进化树分析表明, 大蒜来源的GarLV分离物可以分成4个类群, 我国分离物分别属于4个不同类群.     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物外壳蛋白基因与3'非编码区的序列分析

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) 为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,Tobamovirus属病毒基因组至少编码4个蛋白,靠近5'端的126 kDa和183 kDa两个蛋白与病毒的复制有关,其中183 kDa是由126 kDa 蛋白终止子超读产生的;另外两个蛋白分别为约30 kDa的移动蛋白(Movement protein, MP)和约17.5 kDa 外壳蛋白(Coat protein, CP),这两个蛋白分别由不同的亚基因组RNA表达产生;病毒基因组5'和3'端均含有一段非编码区(Noncoding region, NCR),5'端含帽子结构,3'端有一个可接受组氨酸的类似tRNA状结构[1].     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(NPV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(EoPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16％的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31．5kDa和28．8kDa的衣壳蛋白，后者的含量是前者的2、5倍。3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾，编码RNA聚合酶(RdRp)，含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序，同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(PnPV)亲缘关系最近。这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒。     

内部核糖体进入位点研究现状及应用展望

内部核糖体进入位点 (ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅ ,ＩＲＥＳ)是最早发现于动物病毒基因组 5′非编码区的一段ＤＮＡ序列 ,它具有不依赖于 5′帽子结构的翻译起始功能。1 .ＩＲＥＳ的发现基因的表达分为转录和翻译两个相互独立但又紧密联系的阶段。正常情况下真核细胞的ｍＲＮＡ前体转录完成后 ,经过剪接、5′端加帽、3′端加尾等修饰过程生成成熟的ｍＲＮＡ。 5′帽子结构除了能使ｍＲＮＡ免遭核酸酶和磷酸酶的攻击 ,在随后的翻译起始中也起到十分重要的作用。核糖体小亚基通过识别ｍＲＮＡ 5′端帽子结构来寻找蛋…