人白介素6受体结合功能域的构效关系研究

以分子对接（docking）方法研究人白介素6受体胞外区配基结合功能域“WSXWS”区氨基酸残基定点突变对受体与配基人白介素6结合时的相互作用能量、分子间相互作用的影响,从分子力学、分子动态学分析了人白介素6受体胞外区功能域关键氨基酸残基在受体与配基结合中的构象变化以及与人白介素6间的相互作用.     

剪切流动法研究表面固定化配基与目标分子的相互作用力

基于剪切流动腔技术,以微球作为受力载体,设计了一套可用于研究表面固定化配基与目标分子特异性相互作用力的实验和分析方法,并以人免疫球蛋白 G (human IgG) 和羊抗人免疫球蛋白 G (goat anti-human IgG) 分别作为模型配基和模型目标分子进行了研究 . 基于平面 Poiseuille 层流模型设计了流场参数,以数值计算结果验证了设计的合理性 . 使用牛血清白蛋白 (BSA) 作为非特异性对照,判断微球与基片表面的结合力来自配基和目标分子的生物特异性相互作用,并由进一步的目标分子灭活对比实验确认了这一结论 . 实验观察到微球与基片表面的结合力受到配基面密度的影响,说明发生结合的是多对而非单对蛋白质分子 . 将 95 ％的微球被剥离时对应的壁面剪切率设定为临界剪切率,由大量实验结果拟合得到了临界剪切率与配基面密度间的定量关系 . 在受力分析模型中,考虑到多分子的结合,以及分子键位置不同造成的力臂长度的差异,最终计算得到单对配基与目标分子的平均结合力约为 342pN.     

光亲和标记法——分子药理学研究中的一项新技术

光亲和标记技术(photoaffinity labeling technique)是研究生物膜受体在分子水平上阐明配基(ligand)与受体(receptor)相互作用的重要方法。此技术是以照光使一个配基衍生物以共价键方式标记特异性受体蛋白。常用的光反应性配基衍生物有两类,即偶氮化合物(diazo)和叠氮化合物(azide)。芳香叠氮类化合物(aryl azide)是最理想的光亲和标记物,在配基—受体相互作用的研究中应用较广。     

豚鼠心房存在苯环立啶受体

用氚标记苯环立啶([~3H]-pcp)与豚鼠心房匀浆蛋白作受体结合试验。结果表明豚鼠心房具有与[~3H]-PCP 相结合的部位,结合具有特异性、饱和性、可逆性和立体专一性。Scatchard 分析,豚鼠心房有两个不同亲和力的特异结合部位;高亲和力和低亲和力结合部位。两者的解离常数 K_(dl)和K_(d2)分别为12.15±0.414nmol/L 和561.23±121.36nmol/L,最大结合 B_maxl 为0.71±0.029 pmol/mg 蛋白,B_maxe 为1.047±0.099 pmol/mg 蛋白。竞争性抑制分析结果显示 PCP 受体和 sigma 受体的配基都可抑制[~3H]-PCP 的结合,PCP 受体的配基的抑制作用强于 sigma 配基,而广谱阿片激动剂埃托啡(etorphine)却无抑制作用。结果提示豚鼠心房存在 PCP 受体。豚鼠右心房的冰冻切片和[~3H]-PCP 进行体外受体结合放射自显影,结果显示,在心房肌层有与[~3H]-PCP 特异性结合部位,且呈比较均匀的散在分布。     

抗体Fc片段特异寡核苷酸配基介导的实时定量免疫PCR

目的:利用小鼠IgG抗体Fc片段高特异、高亲和寡核苷酸配基,构建实时定量免疫PCR检测方法,提高抗体检测的灵敏度。方法:用SELEX技术从随机寡核苷酸文库中筛选抗体Fc片段特异寡核苷酸配基,设计合成信标序列,通过不对称PCR法,制备IgG Fc片段的核酸信标配基分子;32P标记核酸信标配基,采用琼脂糖凝胶阻滞双显色法鉴定核酸信标配基与IgG Fc片段结合的亲和力和特异性;制备IgG Fc特异性寡核苷酸信标配基-抗体复合检测分子,构建小鼠IgG Fc片段特异核酸信标配基介导的实时定量免疫PCR检测方法。结果:制备了IgG Fc片段的核酸信标配基分子;凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮蓝二次染色结果显示该核酸信标配基分子与IgG Fc片段具有高度亲和力和活性,而且只与非变性IgG结合,与变性IgG不结合;IgG Fc片段的特异核酸信标配基与IgG结合形成复合检测分子,有效完成了信号传递和实时定量PCR信号放大过程。结论:初步建立了一种全新的核酸信标配基介导的免疫PCR检测方法,可有效提高现有IgG类抗体免疫检测的灵敏度和特异性。     

植物Rubisco活性中心的模拟分析

通过对与不同配基结合的植物Rubisco复合物结构的重叠比较分析 ,发现Rubisco的活性差异是由其中一段Loop6环序列所造成的 ;金属离子与活性中心的结合会造成活性中心巨大的构象变化 .进一步用SwissPDBViewer软件模拟不同配基的植物Rubisco活性中心与此Loop环的氢键相互作用 .结果表明 ,有 3个Lys残基Lys2 0 1、Lys334、Lys175与Rubisco是否处于活性状态密切相关 ,这些残基的结构变化对分子设计可能有重要的参考价值     

G蛋白偶联受体介导的神经信号跨膜转导

Ｇ蛋白偶联受体介导的神经信号跨膜转导郭君,周安武,杜雨苍（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词Ｇ蛋白偶联受体,神经信号跨膜转导受体是细胞膜或细胞内的一些首先能与生物活性物质相互作用的分子,它们能够识别配基并与其结合,然后将受体与配基...     

胰岛素蛋白质工程研究进展

近年来,胰岛素蛋白质工程研究进展很快,主要介绍具有临床意义的速效长效和高效胰岛素研究概况,包括分子设计基础,生物活性和应用前景等.此外,还讨论了胰岛素的受体结合部位及胰岛素与其受体相互作用的研究近况．     

蛋白质多肽激素生物发光配基-受体结合测定新方法

蛋白质多肽激素是一大类内源信号分子,通过激活靶细胞膜上特定受体发挥重要调控功能。配基-受体结合测定是研究蛋白质多肽激素与受体相互作用的重要实验方法,但传统方法要使用放射性同位素(如碘-125),限制了该方法的广泛使用。我们在近期工作中利用超灵敏的Nano Luc荧光素酶建立了"生物发光配基-受体结合测定新方法"用于研究蛋白质多肽激素与受体的相互作用。该方法具有灵敏度高、重复性好、安全无害、操作简便等的优点,有望广泛用于蛋白质多肽激素与受体相互作用研究。     

人白细胞介素-6受体胞外区配基结合功能域活性部位的三维构效关系

以人生长激素受体(K52-L251)的晶体结构为模板, 同源模建人白细胞介素-6受体(hIL-6R) (V106-P322)的空间结构, 并预测与配基(IL-6)结合的活性部位. 根据hIL-6R配基结合功能域中重要氨基酸点突变对活性部位空间构象的影响, 验证预测部位的正确性. 理论分析表明, hIL-6R配基结合功能域中4个保守的半胱氨酸(Cys), 近膜侧193位Cys及"WSEWS"主型框架的点突变均导致受体与配基的结合受阻;而211位Cys, 277位Cys点突变却有利于受体与配基的结合. 研究结果提示, 预测的hIL-6R的活性部位确是hIL-6R和配基(IL-6)结合的分子基础, 可以作为进行小分子hIL-6R拮抗剂设计的靶部位.     

Cry1A毒素与二化螟中肠刷状缘膜囊泡受体蛋白配基结合分析

分离和鉴定二化螟Chilo suppresalis幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中Cry1A毒素的受体蛋白,对于阐明Cry1A毒素作用机理和二化螟抗性机理具有十分重要的意义。为此,本文就Cry1A毒素对二化螟杀虫活性及Cry1Ac与二化螟中肠受体的配基结合进行了研究。结果表明: Cry1Ab对二化螟室内品系(CN)的毒力高于Cry1Ac,而Cry1Ac高于Cry1Aa。配基结合分析表明二化螟CN品系幼虫中肠BBMV中有6个Cry1Ac结合蛋白(分子量分别为50,70,90,120,160和180 kDa), 其中180,160和90 kDa结合蛋白的条带颜色明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白具有较高的结合浓度。同源竞争结合研究表明,180和90 kDa结合蛋白为Cry1Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cry1Ac和Cry1Ab受体结合部位的相互作用,进行了异源竞争结合研究。Cry1Ab可以与Cry1Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,与180,120,70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性。结果显示,Cry1Ac与Cry1Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上拥有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合性有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cry1Ac和Cry1Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。     

糖及其衍生物对胰岛素与其受体相互作用的影响

Cuatrecasas报道除去细胞表面的神经氨酸并不影响被处理细胞与胰岛素的结合能力,但继神经氨酸后再除去半乳糖,就使被处理细胞与胰岛素的结合能力降低。前文报道若干外源凝集素对胰岛素与其受体相互作用的影响,推测胰岛素受体分子上与胰岛素结合部位或其附近存在着甘露糖或葡萄糖。Kazten曾研究了一些糖类或其衍生物对胰岛素和其受体结合的影响,但结论似乎不很明确。本文报告若干单糖、低聚糖及糖苷对胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体相互作用的影响。     

小鼠天然可溶性VEGF受体基因sflt-1的克隆及鉴定

 可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (sFlt 1 )与膜表面受体Flt 1竞争结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF) ,并且与膜表面受体Flt 1及KDR形成异源二聚体 .完全阻断VEGF的生物学活性 ,除与sFlt 1的结合部位结构域有关外 ,还与整个蛋白质分子的高效分泌表达有关 .而蛋白质分子的高效分泌表达与蛋白质在细胞内高尔基体及内质网的加工密切相关 ,基因工程重组可溶性受体由于一些尚未明了的原因 ,往往不能高效表达 ,从而大大影响了其应用价值 .利用RT PCR技术从胚胎小鼠中扩增出天然可溶性VEGF受体基因sflt 1 ,克隆于pcDNA3载体中 ,在COS 7细胞中短暂表达 ;并克隆至pET42b载体中 ,经IPTG诱导后 ,可大量稳定表达与His Tag形成的融合蛋白 ,经HisNi柱纯化 ,可特异性结合VEGF .可溶性受体sFlt 1在肿瘤组织的高效表达可有效阻断新生血管的形成 ,从而为肿瘤的治疗探索一种方法 .     

RanBPM结合干扰素λ信号通路中的干扰素受体1

最新发现的干扰素λ表现出抗病毒、抗增殖和促凋亡活性,同I型干扰素一样干扰素λ结合干扰素λ受体复合体后进行信号传递.干扰素受体是由干扰素受体1和白介素10的受体2形成异二聚体,但是干扰素λ信号通路的分子调控机制仍不清楚.本研究分别运用谷胱甘肽巯基转移酶沉淀试验和免疫共沉淀试验证明了Ran蛋白的结合蛋白RanBPM与干扰素λ受体1相互作用.干扰素λ1能够促进干扰素λ受体1与RanBPM的相互作用和影响RanBPM在细胞内的分布.干扰素λ受体1与RanBPM的相互作用与保守的TRAF6的结合位点无关.RanBPM作为一个支架蛋白通过调控干扰素刺激反应元件的活性,是新的调控干扰素λ途径的蛋白.     

单细胞LDL受体与清道夫受体活性的同时测定

结合应用激光扫描共聚焦显微镜系统(LSCM)和DiI-AcLDL及BODIPY FL-LDL两种荧光配基选择性标记技术,可在单细胞水平上同时测定LDL受体和清道夫受体活性.C57BL/6J小鼠巨噬细胞用终浓度为5mg/L的 DiI-AcLDL及BODIPY FL-LDL,在37℃负载5 h左右的条件下可获得良好的标记效果.两种荧光配基选择性标记具有高度特异性,在激光共聚焦显微镜下可清晰、定量地观察细胞对LDL和AcLDL摄入,是一种灵敏度高且可定量研究LDL受体和清道夫受体功能的非同位素方法.     

表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白αⅡbβ3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白αⅡbβ3是血小板上的一种钙依赖性膜受体,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合.通过将含有NTA-DOGS的磷脂单分子层膜转移到50 nm厚的金膜上,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振(SPR)传感器敏感膜.设计并合成了含有6个组氨酸和RGD基团的His-tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca2+、Mn2+对该相互作用的影响进行了研究.结果表明,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面,并能够保证P1维持一个有效的定向.将Ca2+从低结合位点去除或加入Mn2+都能够增加整合素蛋白的配基结合活性.二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用,可能在整合素发挥其生理功能的过程中具有重要的意义.     

重组人P-选凝素及P-选凝素糖蛋白配基-1的表达与鉴定

P-选凝素表达于血管内皮细胞及血小板膜上,它可以与白细胞膜表面的P-选凝素糖蛋白配基-1(P-selectin glyco-protein ligand-1,PSGL-1)相互作用,在炎症过程中介导白细胞的滚动并启动随后的白细胞迁移级联过程.我们构建了重组人野生型可溶性P-选凝素及其钙离子结合位点突变体,同时构建了重组PSGL-1免疫球蛋白融合分子(PSGL-1-Rg),并应用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达这些重组蛋白,最后用镍金属螯和柱或Protein A亲和柱予以纯化.结果显示,用该系统表达的P-选凝素或PSGL-1是有活性的,但是P-选凝素的4个钙离子结合位点突变体却没有活性.该研究证明了P-选凝素钙离子结合位点在其与配基相互作用中的重要性.     

蛋白质相互作用研究的新技术与新方法

目前,蛋白质相互作用已成为蛋白质组学研究的热点. 新方法的建立及对已有技术的改进标志着蛋白质相互作用研究的不断发展和完善．在技术改进方面,本文介绍了弥补酵母双杂交的蛋白定位受限等缺陷的细菌双杂交系统;根据目标蛋白特性设计和修饰TAP标签来满足复合体研究要求的串联亲和纯化技术,以及在双分子荧光互补基础上发展的动态检测多个蛋白质间瞬时、弱相互作用的多分子荧光互补技术．还综述了近两年建立的新方法：与免疫共沉淀相比,寡沉淀技术直接研究具有活性的蛋白质复合体;减量式定量免疫沉淀方法排除了蛋白质复合体中非特异性相互作用的干扰;原位操作的多表位－配基绘图法避免了样品间差异的影响,以及利用多点吸附和交联加固研究弱蛋白质相互作用的固相蛋白质组学方法.     

分子对接在基于结构药物设计中的应用

分子对接是研究分子间（如配体如受体）相互作用,并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来,分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术,在数据库搜寻,组合库设计及蛋白作用研究方面得到了广泛发展。     

反义肽及其在生化分离中的应用

反义肽是由反义RNA编码和翻译的肽．它可与其正义肽分子发生专一性相互作用．近年反义肽的这种特异性结合实例研究,已为其在生化分离领域应用奠定了基础,尤其是在色谱亲和配基的选择方面,可以预见不久以反义肽为配基的亲和色谱将是生物工程产品分离的一种有效手段．