用简化的微量方法分析EGF受体基因在培养细胞中的表达

利用放射性同位素标记的基因片段或cDNA探针进行核酸分子杂交是分析基因表达的有效手段。将细胞DNA或RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上,然后与放射性探针杂交,即Southern印迹法和Northern印迹法已被普遍采用,为了简化操作,也常使用(Dot Blot)点印迹法。利用上述技术进行基因或基因产物分析时,首先需要从细胞分离、纯化RNA和DNA。如果需     

地高辛素标记的探针快速检测HBV-DNA实验研究

应用核酸分子杂交技术,检测血清中HBV-DNA已成为诊断乙型肝炎病毒感染和判断其复制状态的重要手段。用同位素(~(32)P)标记核酸探针,进行分子杂交,虽然灵敏度高,但是由于具有半衰期短、探针不稳定、价格昂贵、对人体有害等因素,使之推广应用受到限制。目前国内外已有地高辛素(Dig)标记HBV-DNA探针进行斑点杂交实验,敏感性接近同位素探针水平。我们参照BM公司试剂盒方法及有关文献,建立Dig标记HBV基因探针方法,采用随     

生物素标记检测在基因探查中的应用

生物素标记检测技术用于分子杂交已有数年历史,并有很多成功的报道。其原理是用生物素标记的核酸探针进行分子杂交,尔后用免疫组化技术显示杂交结果。它具有快速、准确等优点,特别是避免了使用放射性同位索。它可用于细胞学、染色体及分子学标本,甚至石蜡切片。当然,此方法的灵敏度尚不及放射性探针,且常有本底过高。     

异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的探针在乙型肝炎病毒核酸杂交中的应用

应用异羟基洋地黄毒甙元标记的探针,检测了人和鸭的血清及肝脏中的乙型肝炎病毒核酸,并与~(32)P标记的同位素探针做了比较。结果证明,该探针的特异性和敏感性与同位素探针一致(0.2pg)。它可用于各种核酸杂交试验,如打点杂交、Southern和Northern转印杂交试验等。恰当地从标本中提取待测核酸,是应用该探针的重要条件。     

“缺口翻译”法制备~(32)P 标记DNA探针和几种核酸杂交技术

定性或定量检测天然DNA或重组DNA中某些特殊的顺序片段,分子杂交是最常用的方法。近几年,核酸的分子杂交技术日趋完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。核酸分子杂交方法的灵敏性主要取决于同位素标记杂交探针的比放射性强度。因此制备高比放射性探针是提高灵敏性的关键。用缺口翻译方法制备较稳定的高比放射性强度的杂交探针,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一个理想的工具。本文介绍我们建立并改进“缺口翻译”制备P标记的探针方法,以及几种重要的核酸固相杂交技术。     

镧系元素标记核酸探针技术

镧系元素标记核酸探针技术是利用某些镧系元素及其螯合物作为标记物,通过多种标记方法合成镧系元素核酸探针,用时间分辨荧光测定法进行检测,可以代替放射性核素标记探针进行各种检测和分析。该方法具有灵敏、快速、安全、简便、经济等特点。     

荧光探针研究新进展

自从Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）首次进行ＤＮＡ探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｋｒｉｉｃｋａ总结了各种杂交方法,将其归为两大类;一是异相杂交（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）即液相杂交,一般届时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有     

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

本试验用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ,ＤＩＧ）标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒（ＩＢ－ＤＶ）的方法,并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于ＩＢＤＶＳＴＣ－ｌｌ９和ＳＴＣ－２４３ｃＤＮＡ。杂交方法的敏感性试验表明,核酸杂交可以检测到０．１ｐｇ的ＩＢＤＶＲＮＡ;与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于ＩＢＤＶ早期感染的诊断;而同琼脂扩散试验的比较则说明,杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感１０４倍以上。除此之外,由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便,因而具有很大的应用前景。     

核酸杂交技术及其在登革病毒中的应用

<正>一、引言 核酸杂交技术是一种发展很快、应用极广的分子生物学方法。它利用核苷酸碱基互补配对的原理,通过一段已知特异性的核酸分子,标记上特定的示踪物质作为探针,在液相或固相中与待测标本中的特异性核酸反应,探针与标本核酸的互补单链经氢键作用而形成双链。然后,通过一定的程序显示杂交双链的存在、状态、大小或数量进行检测。故核酸杂交亦称分子杂交(moiecular hybridization)。     

地高辛配基标记探针在流行性出血热尸检组织中原位分子杂交技术的应用和探讨

将地高辛配基(Dig)标记的探针应用于流行性出血热(EHF)尸检组织的石蜡切片中,进行原位分子杂交四例。方法要点:(1)采用Dig标记的探针及碱性磷酸酶系统、提高其敏感性;(2)为达到被检核酸的暴露彻底、准确,选择合适的消化酶;(3)选择适当的杂交温度和时间,防止了非特异性背景,并避免了组织脱片。结果表明此方法操作简便、安全、快速、敏感。     

异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针在丁型肝炎病毒核酸杂交中的应用

应用异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的RNA探针,检测了人和黑猩猩血清及肝脏中丁型肝炎病毒核酸,并与~(32)P标记同一探针做了比较。结果表明,异羟基洋地黄毒甙元标记的RNA探针的杂交效果与同位索探针一致(同源cDNA0.2pg),可用于人和动物血清及肝脏标本内HDV核酸的检测。     

用碘标记核酸检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因

用同位素碘化钠直接标记核酸。以细胞内原位杂交实验检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因。共检查病理确诊的10例鼻咽癌活检标本的细胞涂片,其中9例直接证实有EB病毒核酸。本文建立并改进了细胞内原位核酸杂交技术,首先使用重组的单链DNA作探针,并将碘标记的核酸用于原位核酸杂交实验。     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

分子灯塔设计核酸测定原理及应用

分子灯塔是一种在分子杂交基础上发展的一种荧光探针。这种探针５′端标记荧光物质,３′端连接荧光淬灭剂,而且在５′端和３′端设计互补碱基序列,使探针形成茎环结构。在检测核酸时具有快速、重复性好、灵敏度和特异性高、结果明确等优点。本文就分子灯塔的设计原则、分子特点和在核酸测定中的应用前景简要综述。     

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前,首先以所谓“DNA缺口翻译”的方法制备用同位素标记的DNA(探针)。即把待标记的已知DNA分子用核酸酶(DNase)切成缺口,加入能识别并附着在缺口上的大肠杆菌     

应用生物素标记DNA探针检测伪狂犬病病毒的研究

应用生物素标记ＤＮＡ探针检测伪狂犬病病毒的研究王琴,郭万柱,阴文奇（四川农业大学动物科技学院,四川雅安,６２５５０１４）关键词伪狂犬病毒,核酸,杂交,检测核酸杂交技术已广泛用于检测畜禽疱疹病毒和其它动物病毒,已报道ＰＲＶ－ＤＮＡ的探针方法有ＲＮＡ－Ｄ...     

基因扩增产物的固相杂交-酶联显色方法的建立

建立基于基因扩增技术的简便、快速的病毒核酸定量检测方法．将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的病毒基因产物,与通过共价键结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．应用本方法对血清中乙型、丙型肝炎病毒核酸定量检测,灵敏度分别可达１－５拷贝／反应．此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、半定量指标客观,可广泛应用于肝炎病毒感染的临床诊断和疗效评价．     

定量测定DNA杂交物的灵敏方法——时间分辨荧光法

<正>核酸杂交不仅广泛用于分子生物学,而且也用于诊断医学等领域,这就需要有一种稳定、非放射性探针,到目前为止,用于杂交探针的非放射性标记物有:(1)用抗生物素或抗生蛋白链菌素检测的生物素化的核苷,(2)用于免疫学检测的半抗原以及(3)与核酸交联的蛋白质。所有这些方法,最终都要用酶催化显色来检测杂交探针分子,尽管这类非放射性标记探针可以在高浓度使用(这可以增加杂交速率),但是,其检测灵敏度和简易性都无法与放射性核酸     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。