SDS-PAGE法测定His-tag融合蛋白分子量产生偏差的原因

Ｈｉｓｔａｇ／ＮｉＮＴＡ系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。ＳＤＳＰＡＧＥ是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测Ｈｉｓｔａｇ融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大,产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题,本实验室在研究一个Ｈｉｓｔａｇ融合蛋白Ｐ７３Ｈｉｓ时,首先用ＳＤＳＰＡＧＥ法测得其分子量确实比理论计算值大,然后对其进行Ｃ末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析,结果证实其实际分子量与理论值一致。酶切去除包括Ｈｉｓｔａｇ在内的部分肽段使ＳＤＳＰＡＧＥ法测量蛋白分子量的偏差大大降低,证实Ｈｉｓｔａｇ确实是造成偏差的原因之一。推测由于Ｈｉｓｔａｇ中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在ＳＤＳＰＡＧＥ中迁移变慢,而导致偏差。这一现象值得引起有关研究者的注意。     

地衣芽孢杆菌β—甘露聚糖酶的纯化及其性质的研究

地衣芽孢杆菌１Ｂａｃｉｕｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＬ－３０６产生的胞外β－甘露聚糖酶经硫酸铵分级盐析,ＤＥＡＥ－纤维素柱层析。Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ１００柱凝胶过滤和ＤＥＡＥ－纤维素柱再层析分离纯化,得到ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）均一样品。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得纯化后β－甘露聚糖酶分子量为２６０００道尔顿。用凝胶等电聚焦电泳（ＰＡＧＥＩＥＦ）测得等电点ＰＩ为５．０。该酶     

地衣芽孢杆菌β—甘露聚糖酶的纯化及酶学性质

地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＫ－２７菌株发酵产生的β－甘露聚糖酶（β－ｍａｎｎａｎａｓｅ）经硫酸铵盐析沉淀,两次ＤＥＡＥ纤维素和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００离子交换柱层析以及制备ＰＡＧＥ等步骤,获得了凝胶电泳均一的样品。用ＳＤＳ－凝胶电泳测得纯化后的β－甘露聚糖酶分子量为２６ｋＤ,用凝胶聚焦电泳测得等电点Ｐ１为５．０。酶反应的最适ｐＨ为９．０,最适温度为６０℃,稳     

高压快速柱分离纯化牛血球超氧化物歧化酶的研究

以牛血球为材料,经溶血等处理和丙酮沉淀,获得牛血球超氧化物歧化酶粗品。此粗酶可以通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ快速柱层析,获得超氧化物歧化酶纯品。纯化的酶比活可达１３５００ｕ／ｍｇ,经ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和快速蛋白液相色谱（ＦＰＬＣ）检测,结果表明,纯化酶是均一的Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤测得该酶分子量为３１,８００,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得亚基分子量为１５     

盐生杜氏藻生油—3—磷酸脱氢酶的分离化及其特性的研究

利用ＰＥＧ分级,ＤＥＡＥ离子交换层析,Ｂｈｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ拟亲和层析,ＭｏｎｏＱ离子交换层析等手段,分离纯化直二氏藻甘油三磷酸（Ｇ－３－Ｐ）脱氢酶（ＥＣ１．１．１．８）得到比活为１２．６ｕ／ｍｇ的电泳纯的酶,并对此酶的生化特性进行了研究。４－２０％非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得全酶分子量约为２７０ｋＤ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明该酶只有一种分子量约为６５ｋＤ的亚基,据此推测该酶应为同四聚体。酶     

枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质

三草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ９６０２产生的中性内切β－甘露聚糖酶（ｅｎｄｏ－β－１,４－Ｄ－ｍａｎｎａｎ ｍａｎｎａｎｏｈｙｄｒｏｌａｅｓ,ＥＣ,３．２．１．７８）经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素（ＤＥ２２）离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了４５．５倍,收率为５．９％。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得该酶的分子量为３５ｋＤ。用ＰＡＧＥＩＥＦ测得其等电点ｐⅠ为４．５。酶反应的     

NMT在大肠杆菌中的His6融合表达及其纯化研究

将啤酒酵母ＮＭＴ基因以Ｎ端融合６个组氨酸的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了ＩＰＴＧ诱导的表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析确定有与Ｈｉｓ。－ｒＮＭＴ理论分子量一致的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白的１０％左右;表达产物性质分析表明Ｈｉｓ－ｒＮＭＴ主要以可溶形式存在。在此基础上不受利用固定化金属离子配体亲和层析一步纯化目的蛋白,纯度可达９５％以上。体外标脾性是Ｈｉｓ６－ｒＮＭＴ具有与成熟ＮＭ     

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳纤维蛋白自显影法检测不同分子…

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）纤维蛋白显影方法是经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ将不同分子量的纤溶酶原激活剂（ＰＡ）分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测ＰＡ物质活性及分大小的方法,此法与Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法此具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Ｗｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。本研究用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影方法对本室表达的生组组织型－ＰＡ及突体Ｎ１１７Ｑ     

昆虫谷胱甘肽S-转移酶分离纯化的新方法

谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ,ＧＳＴ）是一类具有多种生理功能的同功酶．从蜡螟幼虫（Ｇａｌｅｒｉａｍｅｌｏｎｅｌａ）的提取液中分离纯化谷胱甘肽Ｓ－转移酶的基本方法如下：首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经１００００ｇ和１０００００ｇ分级离心;取上清液通过ＱＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白;然后采用谷胱甘肽－琼脂糖凝胶亲和层析（ＧＳＨ－ＱＴ４）,四溴酚酞二磺酸盐－琼脂糖凝胶亲和层析（ＢＳＰ－ＱＴ４）,铜离子－琼脂糖凝胶螯合层析（Ｃｕ２＋－ＱＴ４）及ＰＢＥ９４－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＰＢＥ９４）聚焦层析等层析技术进一步分离纯化．将上述方法获得的色谱峰以ＣＤＮＢ和ＤＣＮＢ为底物检测生物活性．具有生物活性部分的蛋白质,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量．实验结果表明,采用ＧＳＨ－ＱＴ４亲和层析法获得的活性峰,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上呈现出两条带,分子量为２４ｋＤ,２４．５ｋＤ左右;Ｃｕ２＋－ＱＴ６螯合层析法分离的活性峰,呈现出一条带,分子量为２４ｋＤ左右;ＰＢＥ９４－聚焦层析法分离获得三个活性峰：第一色谱峰,呈现出一条带,分子量为２３ｋＤ左右     

缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（M—CSF）在大肠杆菌中…

本文用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ基因,并克隆在质粒ｐＡＥＴ３ｄ中,在Ｔ７启动子指导下,在大肠杆菌ＢＬ２ＬｙｓＥ中获得了和一个６组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合Ｍ－ＣＳＦ表达量占菌体总蛋白的１２％,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合（Ｈｉｓ）６－Ｍ－ＣＳＦ在还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上基     

杜仲皮中抗真菌蛋白的分离和特性研究

从杜仲（ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ）皮中分离纯化到一种新的抗真菌蛋白（ＥｕｃｏｍｍｉａＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＰｒｏｔｅｉｎ）,简称ＥＡＦＰ。将切碎的杜仲树皮用ＮａＣｌ溶液在组织捣碎器中高速匀浆提取,经硫酸铁沉淀、ＣＭ一ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ离子交换层析和Ｂｉｏ一ｇｅｌ一ｐ一１０凝胶层析纯化。如此纯化而得的ＥＡＦＰ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶片上显示一条分子量为５．０ｋＤ的单一带。反相ＨＰＬＣ显示４样品是纯的。等电聚焦电泳测得其ｐＩ值大于１１．０。经还原和氨酰羧甲基化处理,用ＨＰＬＣ层析证明ＥＡＦＰ为单链。用酚一硫酸法未测出其含糖。ＥＡＦＰ是简单单链蛋白。氨基酸组成分析结果表明它宫含Ａｒｇ、Ｃｙｓ和Ｇｌｙ,不含Ｍｅｔ,Ｌｙｓ,Ｔｒｐ,Ｈｉｓ和Ｐｈｅ。未经热变性或ＳＤＳ处理的ＥＡＦＰ与考马氏亮蓝试剂不发生显色反应。手工Ｅｄｍａｎ降解法测得Ｎ一端３个氨基酸残基的顺序为Ｇｌｙ一Ａｓｐ一Ａｌａ。用羧肽酶Ａ和Ｂ酶解ＥＡＦＰ测得其Ｃ一末端为Ｖａｌ．０．３ｍｇ／ｍＬ蛋白明显抑制木霉、小麦赤霉菌、烟草黑茎病菌和棉花枯萎病菌菌丝的生长。蛋白在沸水中保温３０ｍｉｎ活性不变。     

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳纤维蛋白自显影法检测不同分子量的纤溶酶原激活剂

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）纤维蛋白显影方法是经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ将不同分子量的纤溶酶原激活剂（ＰＡ）分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测ＰＡ物质活性及分子大小的方法。此法与Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法比具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。本研究用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影方法对本室表达的重组组织型－ｐＡ（ｒｔ－ＰＡ）及突变体Ｎｌｌ７Ｑ／Ｎｌ８４Ｑ／△（Ｋ２９６——Ｇ３０２）及标准尿激酶（ＵＫ）和ｒｔ－ＰＡ进行了分析鉴定。     

限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ的纯化及性质研究

用Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ６３菌为材料,经ＤＮＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＦ３ＧＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步亲和层析,将Ｂｓｐ６３Ⅰ纯化到均一程度。酶比活力达６１４００Ｕ／ｍｇ蛋白。用凝胶过滤法测得该酶分子量为１１３８００。该酶样品在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中呈现为一条蛋白带,并测得其亚基分子量为５６８００。用ＤＮＳ－Ｃｌ法测得该酶Ｎ－末端氨基酸为丙氨酸。上述结果表明该酶分子是由两个相同亚基组成。     

家蚕滞育生物钟蛋白质Ease A4的纯化及其分子结构分析

ＥａｓｅＡ４是家蚕卵的一种滞育生物钟蛋白质．产下后２ｄ的家蚕Ｃ１０８品种滞育性卵,经过丙酮脱脂、８５℃热处理、硫酸铵沉淀和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５凝胶过滤层析初步分离,进一步经过Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８脱盐浓缩,ＨＰＬＣ（柱为ＹＭＣ－ＰａｃｋＰｒｏｔｅｉｎ－ＲＰ）分离,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＭＡＬＤＩＭＳ方法鉴定,纯化得到ＥａｓｅＡ４蛋白质．从１０ｇ蚕卵最终得到了１１．８μｇＥａｓｅＡ４．ＥａｓｅＡ４由从Ｈｉｓ到Ｔｙｒ的１５５个氨基酸残基构成,蛋白质部分的分子量为１６６０１．其２２位氨基酸残基Ａｓｎ处有一个Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ糖基化场所,并有糖基结合在该部位,糖基的分子量约为７６０．ＥａｓｅＡ４的６１位和１５０位的两个Ｃｙｓ氨基酸残基之间存在二硫键．糖基和二硫键的存在不仅有利于酶蛋白的分离,还可能与酶活性有关     

L—山梨糖脱氢酶的纯化及性质的研究

从５Ｌ罐发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｉｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＳＣＢ３２９和Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＳＣＢ９３３混合菌株中差速离心收集ＳＣＢ３２９菌体,破碎,离心获得无细胞抽提液,硫酸铵分级沉淀蛋白后依次经ＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２和Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析分得到了Ｌ－册梨糖脱氢酶（ＳＤＨ）,它能将Ｌ－册梨糖脱氢氧化为Ｌ－册梨酮,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测     

豆薯种子中两种蛋白质的分离纯化及其性质研究

豆薯（Ｐａｃｈｙｒｒｈｉｚｕｓｅｒｏｓｕｓ）种子经磷酸盐缓冲液抽提,Ｓ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ柱,ＤＥ－５２纤维素柱和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析,提取出两种高纯度的蛋白成分,命名为ＰａｃｈｙｒｉｎＩ和ＩＩ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得其分子量分别为３３ｋＤ和１４．５ｋＤ,但ＨＰＬＣ分子筛的结果显示ＰａｃｈｙｒｉｎⅡ的分子量为２８ｋＤ,无论在还原条件下,还是在非还原条件下,ＰａｃｈｙｒｉｎＩ     

四川小麦地方品种Glt—1,Gli—2和Glu—1位点的遗传多样性

运用ＡＰＡＧＥ和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法,研究了８９个四川小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）地方品种Ｇｌｉ－１、Ｇｌｉ－２、Ｇｌｕ－１位点的遗传多样性,在这些地方品种中,总共发现３２种醇溶蛋白带型和３种高分子谷蛋白带型。在Ｇｌｉ－１、Ｇｌｉ－２和Ｇｈｔ－１位点上,分别检测出１４．１５和５个等位基因。在每一个位点上,出现频率最高的等位基因分别为Ｇｌｉ－Ａｌｓ（８９％）,Ｇｌｉ－Ｂｌｈ（４６     

蛇毒蛋白C激活物的初步研究

目的：研究蝮蛇毒蛋白Ｃ激活物的分离纯化与理化性质。方法：经ＤＥ５２－纤维素、ＣＭ－Ｓｐｈａｄｅｘ Ｃ－５０、Ｇ－７５柱层析,从安徽芜湖产蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ）蛇毒中纯化一种均一的蛋白Ｃ激活物（ＰＣＡ）。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定分子量约为１５５０００Ｄａ,ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测定等电点为４．８。它能使人血浆的ＫＰＴＴ明显延长,显示出强烈的抗凝活性。通过中和试验与显色肽定量实验表明,     

植物28kD蛋白的纯化及部分性质研究

经丙酮粉、硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析等方法,首次从玉米花粉细胞质粗提物中纯化了一种具有ＡＴＰａｓｅ活性的可溶性蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得分子量为２８ｋＤ,ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测得等电点为８．３。免疫印迹鉴定结果表明该酶蛋白与抗牛脑动蛋白或动力蛋白的抗体无免疫交叉反应。最大紫外吸收波长为２７８ｎｍ,并作了ＣＤ谱分析。底物特异性研究表明：ＡＴＰａｓｅ水解活性最高。药理学研究表明：该酶蛋白可被矾酸钠强烈抑制,但对ＮＥＭ基本不敏感,氟化钠可使酶活力丧失５０％左右,寡霉素、硝酸钾及乌本苷对酶活力没有抑制作用．     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴