AT细胞DNA双链断裂重接修复效率及其忠实性

用脉冲电场凝胶电泳和双标记基因质粒ＤＮＡ转染技术研究辐射敏感的毛细血管扩张性共济失调症患者皮肤成纤维细胞（ＡＴ５ＢＩＶＡ）和正常辐射抗性的人宫颈癌细胞（ＨｅＬａＳ３）ＤＮＡ双链断裂重接修复率及其忠实性。结果表明γ射线照射诱发ＤＮＡ双链断裂的产额和重接修复率,在两株细胞间无差别．而ＡＴ细胞对导入的限制性内切酶ＥｃｏＲＶ产生双链断裂质粒ＤＮＡ的重接修复忠实性显著低于ＨｅｌａＳ３ｔｅ胞,表明ＡＴ细胞易发生ＤＮＡ错误修复,这很可能就是ＡＴ细胞高度辐射敏感性的主要原因。     

一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建

用家蚕核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ与Ａｃ－ＢａｃｉｍｉｄＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,构建转座一穿梭载体Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒ｅ抗的基因ＨＢｅＡｇ整合到Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组ｒＢｍＨＢｅ。结果表明Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕ＢｍＮ细胞和草地夜蛾Ｓｆ９细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ     

人乳铁蛋白基因在昆虫细胞中的表达

将人乳铁蛋白ｃＤＮＡ（ｈＬＦｃ）克隆在质粒ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ位点,构建成转移质粒８ｈＬＦｃ。该质粒ＤＮＡ与ＡｃＮＰＶ ＢａｃＰＡＫ６病毒株基因组ＤＮＡ经共转染草地夜峨培养细胞Ｓｆ２１,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过３轮纯化,结合斑点杂交筛选,获得重组病毒。用蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的Ｓｆ－２１细胞中存在乳铁蛋白基因的表达产物。酶联免疫检测结果表明：重组人乳铁蛋白在     

SA脂质体介导DNA转染细胞的进一步研究

ＳＡ脂质体可高效介导ＤＮＡ转染ＣＶ－１细胞,本文进步研究表明,ＳＡ脂质体还可介导ＤＮＡ高效瞬时和稳定地转染ＣＨＯ和ＣＯＳ细胞。ＳＡ脂质体和ＤＮＡ形成复合物可保护ＤＡＮ不被核酸内切酶和ＤＮａｓｅＩ降解。荧光标记和细胞松驰素Ｂ抑制实验分别表明,ＳＡ脂质体易被细胞吸附,主要通过内吞传送ＤＮＡ进入细胞,而Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ主要通过融合传送ＤＮＡ进细胞。     

重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段,直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间,构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ,将此质粒导入大肠杆菌,经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分,得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体,经检测发现抗ＦＡＳ抗体能诱导Ｕ９３７细胞发生细胞凋亡     

抑制肺癌及乳癌的基因

许多基因编码抑制细胞生长的蛋白质 ,这些基因中的某些基因抑制肿瘤生长 .以前发现ＢＲＣＡ1基因抑制乳癌生长 ,现发现基因ＲＡＳＳＦ1Ａ也是这种基因 .在 2 0 0 1年 5月 2日的ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ上报道的一项研究确认 ,许多肺癌与乳癌缺乏有功能的ＲＡＳＳＦ1Ａ .研究者发现 ,将恢复ＲＡＳＳＦ1Ａ功能的人癌细胞移植到小鼠体内 ,可防止小鼠发生肿瘤 .研究者用外科手术从肺癌和乳癌病人身上取得癌细胞来创建可在实验室生长的细胞系 .从小细胞肺癌病人取得的 32个细胞系中的ＲＡＳＳＦ1…     

一株拓宽宿主范围的昆虫杆状病毒的筛选和木质素酶的异源表达

将ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ和ＢａｍＨＩ酶解的ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ共转染ＳＦ２１细胞,再用子代病毒反复感染ＳＦ２１和ＢｍＮ细胞。经空斑分析纯化,筛选出既能在ＳＦ细胞又能在ＢｍＮ细胞中复制多角体病毒的昆虫核型多角体病毒。限制酶２分析表明筛选所得的病毒为ＡｃＮＰＶＢｍＮＰＶ的杂交型。     

小鼠4.5S RNA逆转座子对Luc基因表达的影响

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Ｌｕｃ基因作为报道基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建了含４．２ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１、ＳＰ２／０和人乳腺癌细胞Ｂｃａ６１。结果表明,小鼠４．５ＳＲＮ     

安徽庐江鸭乙型肝炎病毒LJ-76转染细胞系的建立

为建立鸭乙型肝炎病毒ＬＪ－７６的转染细胞系,将ＬＪ－７６病毒ＤＮＡ插入到ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ位点上,分离得到含有双拷贝ＬＪ－７６ＤＮＡ的重组质粒．通过磷酸钙沉淀方法,将经ＣｓＣｌ等密度离心纯化的ＬＪ－７６ＤＮＡ双体导入到人肝癌细胞ＢＥＬ７４０２中．收集转染细胞的培养液进行蔗糖密度梯度离心,所得沉淀经检测发现含有ＬＪ－７６ＤＮＡ并具有特异性ＤＨＢＶ内源性ＤＮＡ多聚酶活性;对上述样品通过ＤｏｔＥＩＡ检测ＤＨＢＶ核心抗原及表面抗原结果为阳性．Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明转染细胞内存在病毒ＤＮＡ复制中间体ｃｃｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ和ｒｃＤＮＡ,而ｃｃｃＤＮＡ被认为是复制活动较为活跃的标志．电镜观察转染细胞的上清发现有病毒颗粒的存在．     

应用荧光原位杂交和RFLP标记检测多小穗小麦新种质10—A中的黑麦染 …

利用ＡＰＡＧＥ,荧光原位杂交技术和ＲＦＬＰ标记,对导入黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）多小穗等性状创制的小麦新种质１０－Ａ进行了分子标记检测,ＡＰＡＧＥ分析发现,１０－Ａ与其他１ＲＳ／１ＢＬ易位系一样,含有１ＲＳ的醇溶蛋白标记位点Ｇｌｄ１Ｂ３。以黑麦基因组总ＤＮＡ作探针,用中国春（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍｃｖ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ）基因组ＤＮＡ作封阻,与１０－Ａ根尖细胞有丝分裂染     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

Syp Y279和Y304介导了Bcr—Abl与Grb2等蛋白的结合

利用体外定点突变技术获得ＳｙｐＹ２７９Ｆ,Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ突变的ｃＤＮＡ,将这些突变体和野生型Ｓｙｐ分别构ｐＸＭ真核表达载体,转入Ｋ５６２细胞,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明,各转染Ｋ５６２细胞中都有Ｓｙｐ蛋白的表达。免疫沉淀与免疫印迹结果发现ＷＴ,Ｙ２７９Ｆ,Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ等４种Ｓｙｐ在胞内均能直接与Ｂｃｒ－Ａｂｌ结合,体外结合实验结果表明Ｙ３０４Ｆ突变导致了Ｓｙｐ不能与Ｓｈｃ结合,Ｔ２     

小鼠金属硫蛋白ⅠcDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ＰＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ＰＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确,再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ＝     

S(yp) Y279和Y304介导了BcrAbl与Grb2等蛋白的结合

利用体外定点突变技术获得Ｓｙｐ Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ突变的ｃＤＮＡ, 将这些突变体和野生型Ｓｙｐ 分别构建入ｐＸＭ 真核表达载体, 转入Ｋ５６２ 细胞。经Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹证明, 各转染Ｋ５６２ 细胞中都有Ｓｙｐ 蛋白的表达。免疫沉淀与免疫印迹结果发现ＷＴ、Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ等４ 种Ｓｙｐ 在胞内均能直接与ＢｃｒＡｂｌ 结合。体外结合实验结果表明Ｙ３０４Ｆ突变导致了Ｓｙｐ 不能与Ｓｈｃ 结合,Ｙ２７９Ｆ突变则导致了Ｓｙｐ 不能与Ｇｒｂ２ 结合。结论是： 作为“接头蛋白”,Ｓｙｐ 可以介导ＢｃｒＡｂｌ 与Ｓｈｃ 和Ｇｒｂ２ 之间的结合;Ｇｒｂ２ 结合在Ｓｙｐ 的Ｙ２７９ 上,Ｓｈｃ 则结合在Ｓｙｐ的Ｙ３０４ 上     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

热休克后表达受抑基因的分子克隆及其表达特性

以人成骨肉瘤细胞株ＨＯＳ－８６０３为热休克模型,在利用ＤＤｍＲＮＡ方法筛选和克隆了一个热休克后表达受抑基因的ｃＤＮＡ片段的基础上,以该片段为探针,筛选ＨＯＳ－８６０３细胞的ｃＤＮＡ文库,获得该基因的全长ｃＤＮＡ克隆（ＨＳＳＧ－１）;ＤＮＡ序列测定表明该ｃＤＮＡ全长１４５６ｂｐ,编码２７６个氨基酸,经计算机辅助分析,该ｃＤＮＡ序列尚未被报道。经ＲＮＡ斑点杂交证实,该基因的表达于多种组织细胞之中,并且     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

核骨架结合元件功能研究的进展

细胞核骨架结合元件（ｎｕｃｌｅａｒｓｃａｆｏｌｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ,ＳＡＲ）或称核基质结合元件（ｎｕｃｌｅａｒｍａｔｒｉｘ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｒｅｇｉｏｎ,ＭＡＲ）,是８０年代发现的一个新的ＤＮＡ元件。到９０年代初,由于发现ＳＡＲ／...     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。