蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3′5′-羟化酶基因3′末端的克隆和表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.×Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C. Wang)发育种子中克隆到两个查尔酮合酶基因(TaCHS.t1,TaCHS.w1),分别编码394个氨基酸,二者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96.0%和98.9%;而且克隆到一个类黄酮3′5′-羟化酶基因(F3′5′H)3′-末端.分别从长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C.Wang)、蓝粒小麦、白粒小麦和中国春基因组中分离到查尔酮合酶基因(CHS)的全长序列(ThpCHS.tg,TaCHS.bg,TaCHS.wg,TaCHS.csg),它们的核苷酸序列之间具有很高的同源性,且均含有一个内含子(intron),序列差异主要在内含子.通过DNA序列比较,发现一个CHS与亲本之一的长穗偃麦草基因组同源性达100%,一个CHS与另一白粒亲本基因组同源性达99%,表明来自于父、母本的CHS在蓝粒发育的种子中均表达.Southern杂交结果表明CHS在小麦中的拷贝数至少有4个,不同颜色的蓝粒小麦、白粒小麦间拷贝数基本一致,但都与长穗偃麦草有差异,根据以上结果初步判定CHS在蓝粒小麦中属于一个多基因家族.Reverse Northern分析表明CHS在开花后15 d发育的蓝粒小麦中具有较强的表达;花后21 d F3′5′H和DFR的转录本积累显著高于CHS,基本上检测不到CHS的表达.这三个基因在蓝粒小麦中的表达顺序与其他植物花青素合成途径中的基因表达次序一致:CHS先于F3′5′H,F3′5′H先于DFR.实验还表明F3′5′H和DFR在幼叶中表达也较强,CHS仅在发育种子中表达,具有组织特异性.花后21 d,F3′5′H在白粒、蓝粒小麦和中国春种子中均强烈表达,蓝粒小麦CHS和DFR转录本比白粒小麦多.因此,认为在蓝粒小麦中存在花青素生物合成途径,在蓝色色素形成过程中,该途径中的结构基因受到调节基因的调控.