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靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选
引用本文:周蔚,徐忠伟,王凤梅,陈小义,呼文亮,徐瑞成.靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选[J].生物技术通报,2010(11).
作者姓名:周蔚  徐忠伟  王凤梅  陈小义  呼文亮  徐瑞成
作者单位:1. 中国人民武装警察部队医学院细胞生物学与遗传学教研室,天津,300162;中国人民武装警察部队医学院,天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津,300162
2. 天津市第三中心医院肝内科,天津,300171
3. 中国人民武装警察部队医学院,天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津,300162
摘    要:构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1 mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPase α1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响.构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功.ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPase α1 mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05).ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60 h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPase α1mRNA呈时间依赖性,72 h后表达降低约90%.试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显著抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞.

关 键 词:钠钾ATP酶  RNA干扰  HepG2细胞  细胞周期

Construction and Screening of Plasmid Expression Vectors Encoding the Short Hairpin RNA Targeting Na+/K+-ATPase α1 Subunit
Zhou Wei,Xu Zhongwei,Wang Fengmei,Chen Xiaoyi,Hu Wenliang,Xu Ruicheng.Construction and Screening of Plasmid Expression Vectors Encoding the Short Hairpin RNA Targeting Na+/K+-ATPase α1 Subunit[J].Biotechnology Bulletin,2010(11).
Authors:Zhou Wei  Xu Zhongwei  Wang Fengmei  Chen Xiaoyi  Hu Wenliang  Xu Ruicheng
Abstract:
Keywords:
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