Ensifer meliloti 1021烟酰胺酶的酶学特性及3-氰基吡啶调控机理的研究

克隆和异源表达固氮菌Ensifer meliloti 1021烟酰胺酶(NAMase),研究其酶学特性,并探究3-氰基吡啶(3-CP)对该酶的调控机制。PCR扩增获得E. meliloti 1021烟酰胺酶基因(nam)序列,构建含nam的重组质粒并导入Escherichia coli Rosetta(DE3)中异源表达,用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,探究温度、pH、有机溶剂及金属离子对NAMase活性的影响,并对烟酰胺酶进行了固定化研究。结果显示,克隆得到长636 bp的nam,编码的蛋白分子量为22.6 kD,等电点(PI)为5.5。NAMase的最适pH为7.0,在30-50℃温度范围内孵育2 h酶活维持在97.1%以上,最适温度在30-70℃。Ag2+和异戊醇对NAMase的活性抑制率最大。在E. meliloti 1021野生菌株及NAMase过表达菌株转化烟酰胺的过程中3-CP会抑制烟酸的产量,这种效应并非底物抑制作用。