单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响

为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响。利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的Rnase Ⅲ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响。结构域分析结果显示,LM-Rnase Ⅲ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型Rnase Ⅲ -D50A和Rnase Ⅲ -E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应。体外酶活实验表明,Rnase Ⅲ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS的降解活性有所降低(P0.001);第122位谷氨酸突变后,Rnase Ⅲ RncS降解活性极显著下降(P0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM Rnase Ⅲ RncS酶活性的关键位点。