绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备

利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明：IA23187＋6-DMAP组的激活效率和囊胚率（88.7%＆21.6%）均稍高于乙醇＋6-DMAP组（86.4%＆20.4%）,但二组相应数据之间差异均不显著（P〉0.05）,选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率（86.8%vs83.9%）和囊胚率（23.1%vs17.2%）均差异不显著（P〉0.05）,选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明：190V/mm处理组结果（62.4%）显著高于130V/mm（32.8%）和200V/mm（42.9%）组（P〈0.05）.通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%（161/203）,第7~9天囊胚发育率为15.3%（31/203）.所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚（阳性率为54.8%）.随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示：（i）表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;（ii）所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;（iii）通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据.