利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系

通过L₁₆(4⁵)正交试验，研究了镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响，建立了适合于小苍兰ISSR-PCR的反应体系。优化体系为：25 μL PCR反应体系中含有1×Taq酶缓冲液(10 mmol·L^-1 KCl，8 mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄，10 mmol·L^-1 Tris·HCl，pH 9.0，0.05% NP-40)，2 mmol·L^-1 MgCl₂，0.06 U·μL^-1 Taq酶，0.4 μmol·L^-1引物，4.0 ng·μL^-1模板DNA，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6 mmol·L^-1。利用温度梯度PCR，确定了最适宜的退火温度为51.5℃。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础。

Optimization for ISSR-PCR System of Freesia refracta Klatt Through Orthogonal Design

The effects of various factors on ISSR-PCR reaction, such as concentration of Mg²⁺, dNTPs and primers, DNA template and Taq DNA polymerase, were investigated to optimize the ISSR-PCR reaction system of Freesia refracta through orthogonal tests. The optimized ISSR-PCR system of F. refracta incloded 1×Taq DNA polymerase buffer (10 mmol·L^-1 KCl, 8 mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄, 10 mmol·L^-1 Tris·HCl, pH 9.0, 0.05% NP-40), 2 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.06 U·μL^-1 Taq DNA polymerase, 0.4 μmol·L^-1 primer, 4.0 ng·μL^-1 DNA template, 0.6 mmol·L^-1 dNTPs in 25 μL PCR reaction system. By temperature gradient PCR, the optimum annealing temperature was determined as 51.5℃. The optimized system laid the groundwork for ISSR molecular analysis of F. refracta.