一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用 |
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引用本文: | 赵思捷,朱文琦,孙杰,侯俊,王友亮,李永利,李波,鲍春梅,张浩,李伯安.一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用[J].生物技术通讯,2019(4). |
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作者姓名: | 赵思捷 朱文琦 孙杰 侯俊 王友亮 李永利 李波 鲍春梅 张浩 李伯安 |
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作者单位: | 解放军总医院第五医学中心临床检验医学中心;军事医学研究院生物工程研究所 |
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摘 要: | 目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。
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