苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 20kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL21(DE3) ,高效表达了14.1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的50%以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30.4构建表达质粒pHTX42 ,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42 ,经SDS-PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28% ,且其在细胞中累积达细胞干重的6.413% ,比文献报道的25%左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小，而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体，大小约为1.2μm×2.0μm.生测结果显示，包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源，结构和功能奠定了重要的基础。