ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌，具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白，对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用，但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使，参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标，采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异；将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游，采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系；将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100lpir中，采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达；PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列，并纯化His-ToxR蛋白，用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的，说明ToxR抑制c-di-GMP的产生；实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的，表明ToxR抑制它们的转录；lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100lpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性；EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上，而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述，ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成，从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。

ToxR represses the synthesis of c-di-GMP in Vibrio parahaemolyticus