| 以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建 |
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| 引用本文： | 孙红梅,饶志明,李秀鹏,徐美娟,张显,许正宏.以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建[J].微生物学报,2013,53(8):817-824. |
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| 作者姓名： | 孙红梅 饶志明 李秀鹏 徐美娟 张显 许正宏 |
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| 作者单位： | 1. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214122
2. 江南大学药学院制药工程实验室,无锡,214122 |
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| 基金项目： | 教育部新世纪优秀人才计划(NCET-10-0459);国家“973 项目”(2012CB725202);国家“863 计划”(2011AA02A211);国家自然科学基金(21276110，30970056);中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP51306A);高等学校博士学科点专项科研基金(20110093120001);江苏高校优势学科建设工程项目 |
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| 摘 要： | 目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.
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| 关 键 词： | γ-氨基丁酸 钝齿棒杆菌 同源重组 谷氨酸脱羧酶 一步法发酵 |
| 收稿时间： | 2013/1/24 0:00:00 |
| 修稿时间： | 4/7/2013 12:00:00 AM |
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