| 利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2 |
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| 引用本文： | 黄鹏,阎丽萍,张宁,石金磊.利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J].中国生物工程杂志,2018,38(10):55-63. |
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| 作者姓名： | 黄鹏 阎丽萍 张宁 石金磊 |
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| 作者单位： | 1 上海健康医学院临床医学院 上海 2013182 青岛大学附属中心医院 青岛 2660423 上海健康医学院基础医学院 上海 2013184 上海科技大学生命科学与技术学院 上海 201210 |
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| 基金项目： | * 上海市卫生计生委科研课题(201740161);上海市自然科学基金(15ZR1421800) |
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| 摘 要： | 利用甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,h LysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant h LysG2,rh LysG2)生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-h LysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高,发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rh LysG2得到表达。与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23.8%;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187.4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99.0%以上;浊度测定法分析显示,在p H 5.6、30℃和0.1mol/L Na+的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rh LysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。
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| 关 键 词： | 人鹅型溶菌酶2 毕赤酵母 GAP启动子 组成型表达 杀菌活性 |
| 收稿时间： | 2018-04-16 |
Constitutive Expression of Human Goose-type Lysozyme 2 in Pichia pastoris Using the GAP Promoter |
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| Peng HUANG,Li-ping YAN,Ning ZHANG,Jin-lei SHI.Constitutive Expression of Human Goose-type Lysozyme 2 in Pichia pastoris Using the GAP Promoter[J].China Biotechnology,2018,38(10):55-63. |
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| Authors: | Peng HUANG Li-ping YAN Ning ZHANG Jin-lei SHI |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Human goose-type lysozyme 2 Pichia pastoris GAP promoter Constitutive expression Bactericidal activity |
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