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| 四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响 | |
| 引用本文： | 张驰宇,张高红,杨敏,贲昆龙.四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响[J].中国生物化学与分子生物学报,2004,20(3):387-392. |
| 作者姓名： | 张驰宇 张高红 杨敏 贲昆龙 |
| 作者单位： | 1. 江苏大学医技学院生化教研室,镇江,212001 2. 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,昆明,650223;中国科学院研究生院,北京,100039 3. 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,昆明,650223 4. 昆明中海潮生物工程有限公司,昆明市科医路53号,昆明,650106 |
| 基金项目： | 国家自然科学基金项目 (No .3 0 170 894)~~ |
| 摘 要： | 为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 ,并可成功地用于低丰度RNA的准确定量 |
| 关 键 词： | 引物二聚体 荧光实时定量RT-PCR SYBR greenⅠ 四步法 RNA定量 |
| 收稿时间： | 2004-06-20 |
| 修稿时间： | 2003年6月3日 |
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