天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究 |
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作者姓名: | 姚宏兵 吴伸 董贻诚 邵鹏柱 |
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作者单位: | 中国科学院生物物理研究所,香港中文大学生化系 |
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基金项目: | 香港研究基金委员会CUHK11/91基金 |
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摘 要: | 利用多聚酶链式反应(PCR)技术,对天然天花粉蛋白(nTCS)基因在Tyr14和Arg22两个保守残基处同时进行定点突变,即Tyr14变成Phe,Arg22变成Leu,然后克隆到pET-8c高效表达载体上,构建成重组质粒pETY14F/R22L.经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Y14F/R22LTCS.将pETY14F/R22L转化到E.coliBL21(DE3,pLysS)中,进行表达.经CM-SepharoseCL-6B柱纯化,SDS-PAGE鉴定,纯度可达90%.RIP活性测定显示,Y14F/R22LTCS的活性比nTCS降低了7.5倍,活性变化不显著,因此,TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的.但由于Y14F/R22LTCS在E.coli中的表达量与nTCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关.
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关 键 词: | 天花粉蛋白 定点突变 PCR技术 序列分析 重组质粒 基因表达 RIP活性 |
收稿时间: | 1998-06-20 |
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