东亚钳蝎氯毒素通过下调PKM2介导的有氧糖酵解抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性

东亚钳蝎氯离子通道毒素（Buthus martensii Karshch chlorion channel toxin, BmK CT）是一类短链神经毒素，在体内和体外均能有效抑制神经胶质瘤细胞侵袭和增殖。然而，BmK CT抑制胶质瘤细胞增殖活性的机制尚不清楚。本研究采用代谢组学的方法探索BmK CT抑制人脑神经胶质瘤细胞增殖的分子机制。首先，通过蛋白质表达纯化获得带有谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase, GST）标签的BmK CT蛋白和GST蛋白。利用圆二色谱检测两种蛋白质均具有α-螺旋二级结构，并且融合蛋白质GST-BmK-CT热稳定性较好。通过噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide, MTT）法检测GST- BmK CT对神经胶质瘤细胞（U251和A172）增殖的影响。结果显示，与GST处理组相比，1 μmol/L GST-BmK CT处理组对U251细胞的抑制率更明显（U251细胞19 ± 1.1 vs. 2.25 ± 0.95, P< 0.001, 48 h; A172细胞12 ± 1.4 vs. 2.25 ± 1.25, P< 0.001, 48 h）。利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）分析鉴定出细胞内的63种代谢物，通过通路分析和聚类分析证实，GST-BmK CT处理影响神经胶质瘤细胞的有氧糖酵解。根据峰面积统计数据显示，GST-BmK CT处理降低胞内丙酮酸的含量。GST-BmK-CT处理组相比GST组，明显下调胞外培养基的乳酸分泌（16.33 ± 3.78 vs. 35.6 ± 2.31, P< 0.001, 48 h），葡萄糖消耗（2.04 ± 0.09 vs. 2.64 ± 0.04, P< 0.05, 48 h）和胞内腺苷三磷酸（ATP）含量（633.79 ± 0.001 vs. 5392.71 ± 266.67, P< 0.05, 48 h）。结果表明，GST-BmK CT通过下调胶质瘤细胞有氧糖酵解水平降低ATP的生成。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果显示，GST- BmK-CT降低U251细胞丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2, PKM2）在转录水平和翻译水平的表达，进一步发现GST-BmK CT通过下调低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）降低PKM2在转录水平的表达。以上结果表明，BmK CT通过下调HIF-1α的表达，降低PKM2介导的有氧糖酵解从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性。

BmK CT Inhibits the Proliferation of Glioma Cells by Down-regulatingPKM2-mediated Aerobic Glycolysis