| 基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究 |
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| 引用本文： | 黄瑜烨,李碧舟,何颖,孟繁梅,邹泽红,陶爱林,艾云灿.基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究[J].生物技术,2019(1):57-62,102. |
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| 作者姓名： | 黄瑜烨 李碧舟 何颖 孟繁梅 邹泽红 陶爱林 艾云灿 |
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| 作者单位： | 中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室;广州医科大学附属第二医院/广东省过敏反应与免疫重点实验室/变态反应国家临床专科 |
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| 基金项目： | 国家科技重大专项(2016ZX08011-005;2014ZX08011-05B);广州市过敏反应临床医学研究与转化中心建设项目(201604020008) |
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| 摘 要： | 目的]构建敲除Toll Like Receptor 4(TLR4)基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建p X459-sgRNAh TLR4重组质粒,并转入Ha Ca T中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞。测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果。结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85%和90%,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87%)。结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas9系统 TLR4基因 基因敲除 HaCaT细胞株 |
Targeted knockout and functional analysis of TLR4 gene in cell line HaCaT by CRISPR/Cas9 |
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| HUANG Yu-ye,LI Bi-zhou,HE Ying,MENG Fan-mei,ZOU Ze-hong,TAO Ai-lin,AI Yun-can.Targeted knockout and functional analysis of TLR4 gene in cell line HaCaT by CRISPR/Cas9[J].Biotechnology,2019(1):57-62,102. |
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| Authors: | HUANG Yu-ye LI Bi-zhou HE Ying MENG Fan-mei ZOU Ze-hong TAO Ai-lin AI Yun-can |
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| Institution: | (State Key Laboratory of Biocontrol,School of Life Scienes,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China;The Second Affiliated Hospital,Guangdong Provincial Key Laboratory of Allergy & Clinical,Guangzhou 5102275,China) |
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| Abstract: | HUANG Yu-ye;LI Bi-zhou;HE Ying;MENG Fan-mei;ZOU Ze-hong;TAO Ai-lin;AI Yun-can(State Key Laboratory of Biocontrol,School of Life Scienes,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China;The Second Affiliated Hospital,Guangdong Provincial Key Laboratory of Allergy & Clinical,Guangzhou 5102275,China) |
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| Keywords: | CRISPR/Cas9 system TLR4 gene gene knockout HaCaT cell line |
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