高效Rubisco羧化活性筛选体系的设计与构建

【背景】广泛存在于植物、藻类及其他自养微生物中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是卡尔文循环中固定CO2的关键酶及限速酶,在生物质合成和全球碳循环中扮演着重要角色。鉴于Rubisco的重要性以及极低的固碳羧化活性,对Rubisco的筛选进化研究具有重要意义。【目的】构建一种适用于筛选高效Rubisco羧化活性的筛选体系。【方法】分析现有筛选体系对Rubisco羧化活性筛选压力缺失的原因,设计构建适用于高效Rubisco羧化活性的筛选体系,以BWLac产乳酸菌株为宿主,在含有5%CO2的N2环境下厌氧培养,比较不同羧化活性Rubisco对细胞生长的影响,通过HPLC及LCMS检测总乳酸及固定CO2生成乳酸的产量评估筛选体系。【结果】通过终端代谢产物乳酸产生下拉力,以及甘油代谢产生的剩余还原力需要平衡消耗掉的设计靶点,增强Prk和Rubisco的固碳支路代谢通量,加强RuBP对细胞的毒性抑制作用,使细胞生长与Rubisco活性有效偶联,构建高通量筛选办法。在新构建的筛选体系中,Rubisco失活突变体BWLac/197不能生长,Rubisco和Prk双失活突变体BWLac/197-2021生长未受影响,菌落大小约1.58 cm。粗酶液羧化活性相差2倍以上的RBC1和7002,其细胞生长在筛选条件下受不同程度抑制,菌落大小分别有1.06 cm和0.65 cm。通过检测乳酸产量及甘油消耗量对筛选体系验证评估,RBC1消耗甘油1.39 g/L,产乳酸2.82 g/L,其中来自于NaH13CO3的标记乳酸含量为18.05μmol/L,比7002的相应检测结果高1.3-1.6倍,检测结果与筛选体系设计原理相符,即乳酸产量越高,甘油消耗越多,Rubisco羧化活性越高,细胞生长得越好。【结论】成功设计构建了高效Rubisco羧化活性筛选体系,为进化或探索更高羧化活性Rubisco提供有效的高通量筛选办法。