| 嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达 |
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| 引用本文： | 张云博,白仁惠,王春迪,张斐洋,岳春,张震宇,孙付保.嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达[J].微生物学通报,2017,44(1):9-19. |
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| 作者姓名： | 张云博 白仁惠 王春迪 张斐洋 岳春 张震宇 孙付保 |
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| 作者单位： | 1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122；2. 南京林业大学 江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室 江苏 南京 210037,1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122；2. 南京林业大学 江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室 江苏 南京 210037,1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122,3. 河南天冠企业集团有限公司 车用生物燃料技术国家重点实验室 河南 南阳 473000,4. 南阳理工学院生物与化学工程学院 河南 南阳 473004,1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122,1. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目(No. 21176106)；车用生物燃料技术国家重点实验室开放基金项目(No. KFKT2013010)；中国博士后科学基金项目(No. 2015M571666)；江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室资助项目(No. JSBGFC14006)；河南省科技开放合作项目(No. 162106000007) |
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| 摘 要： | 【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。
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| 关 键 词： | 嗜热棉毛菌，β-木糖苷酶，密码子优化，发酵优化，毕赤酵母 |
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