本生烟eIF4Es基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus, CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus, UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病,是危害木薯的主要病害之一。目前尚无有效防治方法,并且特别是缺乏CBSV/UCBSV抗性育种材料。真核翻译起始因子4E (eukaryotie translation initiation factor4E, eIF4E)不仅参与蛋白质的翻译起始,并且Potyviruses的复制和翻译也依赖于eIF4E与病毒基因组连接蛋白(virus genome linked protein, VPg)的相互作用,目前发现的植物隐性抗病基因大部分都是eIF4E家族的等位基因。本研究利用生物信息学方法和RT-PCR技术获得本生烟(Nicotiana benthamiana) eIF4E家族的8个基因,聚类分析显示它们分别编码eIF4E、eIF4E的异构体和类似帽结合的蛋白。为筛选与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E家族蛋白,本研究进一步构建了这8个基因的Lex A-酵母双杂交系统的诱饵载体,并导入酵母细胞EGY48 (p8op-LacZ)进行细胞毒性和自激活检测。结果显示导入重组质粒的EGY48 (p8op-LacZ)酵母细胞在SD/-His/-Ura缺陷型培养基上生长良好,在SD/-Trp/-Ura缺陷型平板上不生长,并且在SD/Gal/Raf/-His/-Ura/X-Gal培养基上不显蓝色,说明重组质粒表达产物不仅对该酵母细胞无毒性,而且对下游报告基因无自激活作用,可用于该系统的互作蛋白筛选研究。本研究为利用酵母双杂交系统发现与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E基因,探索通过基因编辑与CBSV/UCBSV互作的寄主因子进行抗CBSV/UCBSV分子育种提供科学依据。