发展中的mRNA差别显示技术

随着PCR技术的出现（1985），在分子生物学界又相继出现了两个很有影响的新技术－PAPD技术（1990）和mRNA差示法（1992），前者用于分子标记，后者用于基因分离。mRNA差示法的生物学基础是基因的差别表达，即：单个细胞中表达的基因仅占基因总数的15％，这种基因的差别表达决定了生命的所有过程，如：发育和经、对逆境的反应、细胞分裂、老化等。图一给出了该方法最初的技术路线。提取要比较的两种或两种以上样品的mRNAs，分别逆转录成cDNAs，经过PCR扩增后，直接进行测序胶电泳即可识别差别的mRNA。其中、关键是的PCR扩增时两个引物的设计。3′端引物Oligo(dT)MN很容易与具有N′M′－poly(A)-3′末端的大多数mRNA结合，进行cDNA的逆转录合成。M、N提供锚定位点，防止3′端引物在poly(A)序列不同位置上的随机结合。5′端为10个碱基的随机引物。这个经验上的碱基数较理论的6－7个碱基（表一）更能满足测序胶电泳要求的条件：分子大小在500bp左右，每条泳道上条带数在100条左右。该方法近年来又有如下改进：一、PCR退火温度由42℃改为40℃，可在保持特异性的同时，增加泳道上的条带数。cDNA合成的底物改用总RNA，可避免poly(dT）柱纯化mRNA时的污染，造成电泳抹带（smear）现象。二、第二代引物3′端的M位（3′端倒数第二位）碱基改用4个简单碱基，减少了引物的组合数，提高该法的效率和经济性。第三代引物在两种引物的5′端加HindIII酶切位点，3′端引物改为单随机碱基，既：5′－AAGCT11N－3′；5′端引物为5′－AAGCTT＋（AP）7。大大提高了克隆效率和克隆cDNA的可操作性。三、可能由于10个碱基随机引物的特异性还不够，泳道上出现的cDNA条带数多得超过了不可分辨的程度，造成了假阳性现象。有人尝试用不变性凝胶代替变性凝胶、或用Northern亲和层析加以解决。收效不大。也许，还是需要在引物设计上下功夫。四、经比较，^33P的半衰期和放射性强度介于^32P和^35S之间，价格最贵，但效果最好。通过对正常细胞与病变细胞、处理与未处理细胞、不同生理状态和不同发育时期的细胞，以及抗逆性强弱所作的mRNA差别显示分析，在动植物生理、病理以及抗性研究中取得了大量成果。但是，由于该技术要求底物有poly(A）尾，只能限于真核生物核基因组差异表达的研究。而且，所选择的研究材料除要求目的的基因有差异外，其它基因差异要尽可能小。GenHunter公司已推出了方便的专用试剂盒，但使用的是与人有害的、需要较长曝光时间的放射性同位素，这些都是需要进一步改进的，还包括向技术的自动化改进。