Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段,是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中,DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性,可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基,可以快速、高保真地扩增DNA片段,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案,该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达Pfu酶,然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其p H、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明,使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶,完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数,十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶,对于有大量分子克隆要求的课题组,利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。