基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因（Recombination activating genes RAG）是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力，是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼；由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性，又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp，由三个外显子和两个内含子组成，其中开放阅读框长3192bp，编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp，没有内含子，只有单一的编码区，编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的，转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点，提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达，提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组，也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达，在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号，在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号，说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。