| 基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法 |
| |
| 引用本文： | 张敏琳,黄枫淇,左小玲,梁建韬,梁凯珊,单金红,李宗烊,喻婕,罗丽媛,禤梓杰,赵会宏,王庆.基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法[J].水生生物学报,2024(2):283-291. |
| |
| 作者姓名： | 张敏琳 黄枫淇 左小玲 梁建韬 梁凯珊 单金红 李宗烊 喻婕 罗丽媛 禤梓杰 赵会宏 王庆 |
| |
| 作者单位： | 1. 华南农业大学海洋学院;2. 华南农业大学粤港海洋生物资源保护与开发联合实验室 |
| |
| 基金项目： | 国家自然科学基金面上项目(42176103)；;国家重点研发计划(2022YFD2400502)；;广东省自然科学基金面上项目(2022A1515012505)资助~~； |
| |
| 摘 要： | 为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏...
|
| 关 键 词： | 大口黑鲈弹状病毒 CRISPR-Cas13a MIRA 大口黑鲈 |
|
|
