| 摘 要： | 目的构建pc DNA3.1-EV71-2A的突变质粒(EV71-2Amut),并对其功能进行检测,为进一步研究肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)2A蛋白酶的活性位点及其生物学功能奠定实验基础。方法利用聚合酶链式反应(PCR)定点诱变技术,定点突变编码EV71-2A第21His、39Asp和110Cys氨基酸的位点,构建EV71-2Amut,并测序鉴定。将所构建突变质粒与巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子介导的真核细胞荧光素酶报告基因(pRL-CMV)共转染人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞),通过观察转染组的EV71-2Apro和EV71-2Amut对pRL-CMV荧光强度的影响,判断突变质粒的细胞内酶活性。将EV71-2Apro或EV71-2Amut质粒转染BALB/c小鼠股四头肌,用RT-PCR检测局部相应质粒的mRNA水平,并观察局部肌肉组织的病理变化。结果构建的突变质粒EV71-2Amut经测序及比对,结果与预计突变位点一致;在细胞学水平检测到的pRL-CMV荧光强度,EV71-2Amut组比EV71-2Apro组显著增高(P0.05);小鼠股四头肌注射局部均检出EV71-2Apro和EV71-2Amut的mRNA表达,且与EV71-2Apro组相比,EV71-2Amut注射组的肌肉组织的肌肉凝固性坏死、炎症反应病理损伤较轻。结论成功构建了突变的EV71-2Amut质粒,为研究EV71-2A蛋白酶的生物学功能奠定了实验基础。
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