| 摘 要： | 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)作为植物苯丙烷类途径的入口关键酶,对抗肿瘤木脂素——鬼臼毒素的生物合成具有重要影响。桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]是鬼臼毒素的主要天然来源,以四川阿坝地区桃儿七植株的根为材料,基于桃儿七公共SRA转录组数据包,通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆其苯丙氨酸解氨酶基因ShPAL。生物信息学分析表明,ShPAL编码蛋白由711个氨基酸组成,包含PAL保守结构域,有芳香族氨基酸解氨酶活性中心的特征性基序,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,单体三级结构呈现典型的“海马状”,Swiss建模空间结构为同源四聚体,在系统发育谱系上与同属小蘖科(Berberidaceae)的三枝九叶草(Epimedium sagittatum)PAL序列相似度最高、进化距离最短。亚细胞定位实验结果显示ShPAL蛋白主要定位于细胞质中、少量定位于内质网膜上。ShPAL蛋白通过大肠杆菌(Escherichia coli)重组表达和组氨酸标签亲和纯化,其酶活高达20.91 U/mg,最适温度为41℃,最适pH为9.0;其F130H突变体酶活降低约23.6%,但随温度、pH变化的趋势不变,证实该位置的苯丙氨酸确为影响PAL底物特异性的残基;两者的热稳定性均较差,但pH稳定性较好。这些结果将有助于进一步分析ShPAL在鬼臼毒素生物合成过程中的调控作用,以及促进鬼臼毒素异源合成,从而保护桃儿七种质资源,同时也表明ShPAL可在生物化工和生物医学方面具有潜在应用价值。
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