首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
     

基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装
作者姓名:柳云帆  尉迟捷  王刚  田文洪  陆月  刘雪荣  董小岩  郑刚  沈炜  吴小兵  阮力
作者单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所;吉林大学生命科学学院;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室;北京五加和分子医学研究所;
基金项目:创新性艾滋病疫苗的前期研究(2008ZX10001-012); 基因治疗药物关键技术(2009ZX09503-020)资助
摘    要:本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red...

关 键 词:λ-Red重组酶  PCR打靶  腺病毒  Ⅳa2  
本文献已被 CNKI 等数据库收录!
设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号