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| 基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法 | |
| 引用本文： | 李丹丹,李英,吴小桃,鲁云霞,王学军,王升启. 基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法[J]. 生物技术通讯, 2011, 22(5): 647-650,666. DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2011.05.011 |
| 作者姓名： | 李丹丹 李英 吴小桃 鲁云霞 王学军 王升启 |
| 作者单位： | 1. 安徽医科大学,安徽合肥230032;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850 2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850;天津中医药大学,天津300193 3. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850 4. 安徽医科大学,安徽合肥,230032 |
| 基金项目： | 国家传染病防治科技重大专项，国家杰出青年基金 |
| 摘 要： | 目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。 |
| 关 键 词： | Avi-tag 增强型绿色荧光蛋白 BirA酶 人胚肾细胞 亲和纯化 |
A Method for Biotinylation,Purification and Detection of Enhanced Green Fluorescent Protein Based on Avi-tag Technology in Human Embryonic Kidney Cells |
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| LI Dan-Dan,LI Ying,WU Xiao-Tao,LU Yun-Xia,WANG Xue-Jun,WANG Sheng-Qi. A Method for Biotinylation,Purification and Detection of Enhanced Green Fluorescent Protein Based on Avi-tag Technology in Human Embryonic Kidney Cells[J]. Letters in Biotechnology, 2011, 22(5): 647-650,666. DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2011.05.011 | |
| Authors: | LI Dan-Dan LI Ying WU Xiao-Tao LU Yun-Xia WANG Xue-Jun WANG Sheng-Qi |
| Affiliation: | LI Dan-Dan 1,2,LI Ying 2,3,WU Xiao-Tao 2,LU Yun-Xia 1,WANG Xue-Jun 2,WANG Sheng-Qi 2 1.Anhui Medical University,Hefei 230032,2.Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China |
| Abstract: | Objective: To establish and optimize a method for site-specific biotinylation,purification and detection of enhanced green fluorescent protein(eGFP) in human embryonic kidney cells based on Avi-tag technology.Methods: We respectively construct the Avi-tagged eGFP eukaryotic expression vector plenti-Avi-eGFP and BirA enzyme over-expression eukaryotitc vector pQCXIH-BirA,then plenti-Avi-eGFP and pQCXIH-BirA were co-trans-fected into human embryonic kidney cells 293T.After 12 h,we observed that whether the Avi... |
| Keywords: | Avi-tag enhanced green fluorescent protein human embryonic kidney cells affinity purification |
| 本文献已被 CNKI 维普 万方数据 等数据库收录！ | |