甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx原核表达、纯化及酶学性质分析

【目的】谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx)是生物体内依赖硫醇的抗氧化酶，在生物氧化胁迫和细胞凋亡等许多重要的生命活动中发挥作用。本研究旨在测定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧还蛋白家族成员SeGrx1的基因序列以及酶催化反应特性，为揭示其在昆虫体内功能奠定基础。【方法】以前期获得的甜菜夜蛾转录组数据为基础，采用RACE-PCR技术克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全长序列。将甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列连接至pET-16b原核表达载体，转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中，IPTG诱导融合蛋白表达后用镍柱和Superdex75/200分子筛纯化；采用荧光酶标仪测定纯化的SeGrx1的活性及酶促反应动力学参数。【结果】甜菜夜蛾SeGrx1基因(GenBank登录号: MK318813) cDNA全长738 bp，其中5′非编码区长40 bp，3′非编码区长347 bp，开放阅读框(ORF)全长351 bp，编码116个氨基酸，预测蛋白的相对分子量为12.57 kD，活性位点为CPYC，为双巯基谷氧还蛋白。SeGrx1中心由4个平行和反向平行的β-strand混合组成，外围被5个α螺旋包围。成功构建pET-16b-SeGrx1重组质粒并在大肠杆菌中高表达，经过诱导和纯化条件的优化，获得纯度在95%以上的SeGrx1目的蛋白。以人类谷氧还蛋白hGrx1为标准，SeGrx1比活力为0.577 U/mg pro，最大反应速度V_max为20.5 U/mg pro，米氏常数Km为14.3 nmol/L。【结论】本研究成功地在体外大量表达了甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1，并且获得了它的酶促动力学参数，为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能，探索其在害虫防治中的应用提供了基础。

Prokaryotic expression,purification and enzymatic characterization of SeGrx1 of the beet armyworm,Spodoptera exigua(Lepidoptera: Noctuidae)