人酪蛋白激酶1激酶区真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Flag标签的酪蛋白激酶1α(CK1α)激酶区截短突变体CK1α(1-285aa)的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶区与已知相互作用蛋白Myc-Cdc25A之间的相互作用。方法:用PCR技术从人全长CK1α真核表达载体中扩增CK1α(1-285aa),将其克隆到Flag载体中,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达情况,免疫共沉淀分别检测Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A的相互作用。结果:双酶切和基因测序鉴定显示Flag-CK1α(1-285aa)真核表达载体克隆构建成功;Western印迹结果表明Flag-CK1α(1-285aa)转染人胚肾细胞293T细胞后获得表达;免疫共沉淀结果显示Flag-CK1α全长、Flag-CK1α(1-285aa)与Myc-Cdc25A在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论:构建了Flag-CK1α(1-285aa)的真核表达载体,为进一步探讨Flag-CK1α激酶区对细胞信号通路的调节作用奠定了实验基础。