| 摘 要： | 目的:探究一种小分子量类弹性蛋白标签(elastin-like protein tag,ELP tag)——ELP_(30)-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法:人工合成ELP_(30)-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体,结合2种内含肽(intein1和intein2)基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因,构建4个含有不同元件序列的原核表达载体:pET-ELP_(30)、pET-ELP_(30)-eGFP、pET-ELP_(30)-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP_(30);将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,并通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化重组蛋白ELP_(30)、ELP_(30)-eGFP、ELP_(30)-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30),随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)分别诱导intein1和intein2断裂,最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果:利用设计的ELP_(30)-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP_(30)、ELP_(30)-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30);重组蛋白ELP_(30)-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30)中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP,但未能分离获得纯eGFP。由此为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。
|
