果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究 |
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引用本文: | 彭小波,杨江科,陈光军.果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究[J].生物技术,2018(2):170-177. |
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作者姓名: | 彭小波 杨江科 陈光军 |
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作者单位: | 武汉轻工大学生物与制药工程学院 |
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基金项目: | 武汉市科技局科技计划项目("新型饲用耐高温脂肪酶的分子改造与品种创制";No.2016020101010084) |
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摘 要: | 目的]实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。
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关 键 词: | 果胶酶 基因拷贝数 荧光定量PCR 分泌表达 水解工艺 |
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