小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体，转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列，设计特异性的shRNA 序列，应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha，筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞，得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后，Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体，感染MC3T3-E1 细胞后，RelA 基因的表达明显受到抑制，同时RANKL基因表达水平明显下降，ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰，NF-资B 通路被抑制后，小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升，成骨功能增强；同时RANKL 的表达明显下降，其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。

Construction and Identification of a Lentiviral Vector of RNA InterferenceTargeting Mouse RelA Gene