小分子G蛋白Rap1 shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制Rap1基因的表达，构建RaplshRNA（small hairpin RNA．shRNA）表达载体，观察其对小鼠肝脏细胞中RaplmRNA和蛋白表达的干扰作用．根据小鼠RaplmRNA的全序列．设计了3种Rap1 siRNA序列（Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3）和阴性对照序列（HK）；采用克隆技术，将其插入带有报告基因绿色荧光（EGFP）的pGenesi1－3载体，构建RaplshRNA表达载体：经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致：昆明小鼠40只，体重18～20g，随机分成4组：I组（转染HK组）、Ⅱ组（转染RaplshRNAl组）、Ⅲ组（转染RaplshRNA2组）、Ⅳ组（转染Rap1 shRNA3组）．于0、16、24h腹腔内注射Rap1 shRNA2．0－2．5mg／kg（用PBS稀释至1mL）：48h后收集小鼠肝脏．用显微荧光、定量RT—PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1 shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平．I组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60％．Ⅱ组、m组、Ⅳ组的RaMmRNA表达、Rap1蛋白表达均降低．其中Rao1 shRNA1干扰效果最佳．