定向进化和半理性设计改造顺式环氧琥珀酸水解酶

【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid, ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活...