| 新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD |
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| 引用本文： | 闫干干,李东升,戚海燕,付正豪,刘晓平,张晶,陈云雨.新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD[J].生物工程学报,2022,38(6):2236-2249. |
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| 作者姓名： | 闫干干 李东升 戚海燕 付正豪 刘晓平 张晶 陈云雨 |
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| 作者单位： | 皖南医学院 药物筛选与评价研究所, 安徽 芜湖 241002;皖南医学院 安徽省皖南地区植物药活性筛选与再评价工程实验室, 安徽 芜湖 241002;中国医学科学院-北京协和医学院 医药生物技术研究所, 北京 100050 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（81370087，81703546）；安徽省自然科学基金（1808085QH265）；安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2019ZD30，KJ2021A0839，YJS20210549）；皖南医学院大学生科研资助金（WK2021XS54）；皖南医学院青年骨干人才项目（wyqnyx202104） |
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| 摘 要： | 基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。
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| 关 键 词： | 新冠病毒 主蛋白酶抑制剂 荧光共振能量转移 高通量筛选 白花丹素 银杏酸 |
| 收稿时间： | 2021/8/28 0:00:00 |
Discovery of SARS-CoV-2 main protease inhibitors using an optimized FRET-based high-throughput screening assay |
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| YAN Gangan,LI Dongsheng,QI Haiyan,FU Zhenghao,LIU Xiaoping,ZHANG Jing,CHEN Yunyu.Discovery of SARS-CoV-2 main protease inhibitors using an optimized FRET-based high-throughput screening assay[J].Chinese Journal of Biotechnology,2022,38(6):2236-2249. |
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| Authors: | YAN Gangan LI Dongsheng QI Haiyan FU Zhenghao LIU Xiaoping ZHANG Jing CHEN Yunyu |
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| Institution: | Institute for Drug Screening and Evaluation, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China;Anhui Provincial Engineering Laboratory for Screening and Reevaluation of Bioactive Compounds of Herbal Medicines in Southern Anhui, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China;Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | SARS-CoV-2 main protease inhibitor fluorescence resonance energy transfer (FRET) high-throughput screening plumbagin ginkgolic acid |
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